siRNA与癌症治疗的探究.pptxVIP

siRNA与癌症治疗的探究会计学siRNA的简介第1页/共19页 小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）有时称为短干扰RNA（short interfering RNA）或沉默RNA（silencing RNA），是长度20到25个核苷酸的双股RNA，在生物学上有许多不同的用途。目前已知siRNA主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。此外，也参与一些与RNAi（RNA interference 核糖核酸干扰）相关的反应途径，例如抗病毒机制或是染色质结构的改变、阻断细胞内可能发生的有害活动，如肿瘤细胞的生长，但是要成功地将siRNA传送到特异性的细胞中而不对其它细胞产生不利影响还一直是个难题。 本次siRNA的结构第2页/共19页siRNA通常是一段长21个核苷酸的双股RNA（dsRNA），其两股分别在RNA的两端超出另一端2个核苷酸，图示如下： 每一股各有一个5磷酸基末端与一个3羟基末端。此结构经dicer作用而得，dicer是RNase III家族中特异识别双链RNA的一员，它能以一种ATP依赖的方式逐步切割由外源导入或者由转基因病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19-21bp的双链RNAs(siRNAs)。 此外，siRNA也可经由多种不同转染（transfection）技术导入细胞内，并对特定基因产生具专一性的基因敲除（knockdown）效果。本质上，任何已知序列的基因都可以、也因此是经过适当剪裁而具有序列互补性的siRNA的作用对象。这使siRNA成为研究基因功能与药物目标的一项重要工具。RNAi第3页/共19页 RNA沉默是存在于生物中的一种古老现象, 是生物抵抗异常DNA(病毒、转座因子和某些高重复的基因组序列)的保护机制, 同时在生物发育过程中扮演着基因表达调控的角色，它可以通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用，因此在治疗癌症肿瘤中有很大的应用前景。 siRNA发挥RNAi作用的过程第4页/共19页 siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA激活的RISC 通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了，但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。 另外，还有研究证明含有启动子区的dsRNA在植物体内同样被切割成21-23nt长的片段,这种dsRNA可使内源相应的DNA序列甲基化,从而使启动子失去功能,使其下游基因沉默。归纳siRNA的特点21 依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点。 长度约在22nt左右。 生成需要Argonaute家族蛋白存在是RISC组分。 植物体内也存在内源的siRNA。 345第5页/共19页siRNA在RNAi应用中的缺陷第6页/共19页 在RNAi实验中，化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短。针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。 该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。 质粒表达siRNA的优点第7页/共19页 通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。 第8页/共19页带有标记的siRNA表达载体 此外，带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久（比如Clontech（现属于Takara）的RNAi-Ready表达载体）。另外带有荧光标记的siRNA表达载体也受到研究者的重视与欢迎，因为带荧光标记的表达载体，可以让研究人员通过荧光标记很容