人的血红蛋白基因的克隆.pptVIP

* Group 1/2 Step-Summary 步骤简介 1:提取RNA并电泳检测 2:逆转录并扩增 3:转化并培养 4:检测 血红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质，存在于脊椎动物、某些无脊椎动物血液和豆科植物根瘤中。 人体内的血红蛋白由四个亚基构成，分别为两个α亚基和两个β亚基，在与人体环境相似的电解质溶液中血红蛋白的四个亚基可以自动组装成α2β2的形态。 血红蛋白的四级结构对其运氧功能有重要意义。它能从肺携带氧经由动脉血运送给组织，又能携带组织代谢所产生的二氧化碳经静脉血送到肺再排出体外。现知它的这种功能与其亚基结构的两种状态有关，在缺氧的地方（如静脉血中）亚基处于钳制状态，使氧不能与血红素结合，所以在需氧组织里可以快速地脱下氧；在含氧丰富的肺里，亚基结构呈松弛状态，使氧极易与血红素结合，从而迅速地将氧运载走。亚基结构的转换使呼吸功能高效进行。 基因克隆血红蛋白基因可以用于治疗贫血的研究。 背景介绍 提取人体红细胞RNA 1 5×甲醛变性缓冲液5 ? l 甲酰胺 10 ? l 37%甲醛 2 ? l RNA样品 6 ? l 6 ×上样缓冲液 4 ? l 1 2 逆转录反应 总RNA 9 ?l + Oligo dT (0.05?g/ml) 1 ?l 65℃水浴10min，立即冰浴2min 5?RT-buffer 4?l + RNasin (40U/ml) 1 ?l + dNTPs (10mmol/L)4 ?l + AMV 1 ?l 42 oC 水浴1h 将反应管移至 68 oC水浴10min 冰浴 保存备用 1）模板DNA (逆转录后的cDNA） 4 ?l 2）10X PCR buffer(含MgCl2 ) 5 ?l 3）dNTPs(10mM) 1 ?l 4）3 ’引物(10?mol/L) 1 ?l 5）5 ’引物(10?mol/L) 1 ?l 6）Taq DNA 聚合酶(2U/?l) 1 ?l 7）加去离子水 37 ? PCR仪器中进行PCR 反应。25-30个循环后，72度10min。取PCR产物做PCR凝胶电泳，得到电泳产物，观察有无目的基因片段，收集有目的基因片段的凝胶 设计引物 3 得上游引物：5’-CGGCATTGGCTCTTACCC-3’ 下游引物：5’-CATCTCGCCTGGCACTTT-3’ ……… 3 重组DNA 回收的PCR产物（DNA片段） 7 ?l T载体 1 ?l t4 DNA 连接酶buffer 1 ?l T4 DNA ligase 1 ?l 终体积 10 ?l 25oC水浴1h。 感受态细胞的制备 1：大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，置37oC孵箱培养12-16小时 2：挑取单菌落，接种于2ml LB培养基中，37oC, 225rpm水浴摇床中震荡培养12-16h； 3：取1ml上述培养物接种于100ml LB培养基中，37oC, 225rpm水浴摇床 中震荡培养，直至OD值为0.5左右(约3小时)。 取1ml 菌液冰浴5min，6000rpm离心5 min； 4：弃上清，除净剩余液体，轻轻弹匀菌体沉淀，加入100μl 冰冷的 100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟； 5：6000rpm离心5min后，弃上清，轻轻弹匀菌体沉淀，加入100μl冰冷100 mmol/L CaCl2溶液悬浮细胞； 6：4oC可保存1-2周；加甘油至终浓度