重组DNA技术简介.docxVIP

重组DNA技术简介 一、基因工程的相关技术 DNA重组又称基因重组，是指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。 DNA重组技术又称基因工程或基因克隆或分子克隆，是指将某特定的基因，通过载体或其他手段送入受体细胞，在受体细胞中增殖并表达的一种遗传学操作。 图23-1　基因工程基本程序 基因工程的核心技术是DNA分子的切割与连接，其原理与方法如下： 1.DNA的变性与复性 （1）DNA的变性 DNA的变性即DNA熔解，是指加热（超过70℃）、极端的pH、有机溶剂等因素导致DNA配对的碱基间氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开成单链的过程。 （2）DNA的复性 DNA的复性是指变性DNA在适当条件下（如降低温度），两条彼此分开的链又可重新缔合成为双螺旋结构的过程。 （3）杂交分子 杂交分子是指不同来源的两个互补核酸序列通过退火相互缔合形成的双链分子。既可以在两条DNA分子之间，两条RNA分子之间，也可在一条DNA和一条RNA分子之间形成。 2．分子探针寻找特定基因 探针是指一种带有标记的单链DNA或RNA片段，用来检测具有互补序列的核酸序列。 3．分子印迹 （1）Southern blotting：可以检测特定的DNA序列，用于分析基因的结构。 （2）Northern blotting：用来确定不同类型细胞中哪一类基因是活跃表达的。 （3）Western blotting：用于在蛋白混合物中检测特异性蛋白。 4．原位杂交 （1）原位杂交是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。 （2）荧光原位杂交方法是指用荧光染料标记探针直接与细胞中染色体（预先变性的）进行杂交来确定基因在染色体上的特定位置。 5．聚合酶链反应（PCR） PCR是指一种在体外模拟发生于细胞内的DNA快速扩增特定基因或DNA序列的复制过程的技术。一般情况下，PCR由以下3个基本反应组成： （1）高温变性 加热待扩增的DNA样品及其反应体系，使双链DNA变成单链模板DNA。 （2）低温退火 降低反应温度，使引物与2条单链DNA模板发生退火作用，并结合在靶DNA区段两端的互补序列的位置上。 （3）适温延伸 将反应体系的温度上升到72℃保温数分钟，在DNA聚合酶作用下，dNTPs分子便从引物的3＇端加入并沿着模板DNA分子按5＇→3＇方向延伸，合成新的DNA互补链。 如此反复加温冷却，只要有聚合酶和足够的4种脱氧核苷三磷酸，PCR反应的全过程就可以不断重复。 二、基因工程主要的工具酶 1．限制性内切核酸酶 限制性内切核酸酶：即限制酶或限制性内切酶，是指一类在特定的DNA位点切断DNA的酶，能水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，将完整的DNA分子切割成若干片段。 （1）黏性末端是指限制性内切核酸酶切割DNA后产生的两个互补的单链末端。 （2）平齐末端又称钝性末端，是指没有突出的单链的双链DNA分子末端。如用化学合成法、反转录酶酶促合成法获得的DNA片段或cDNA片段，以及某些限制酶酶切产生的DNA片段，均为平齐末端。 2.DNA连接酶 DNA连接酶是一种能够催化DNA中相邻的3＇-OH和5＇-P末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来的核酸酶。 3．反转录酶 反转录酶是指能以RNA为模板，以具有3＇-OH的DNA或RNA为引物，从5＇→3＇聚合生成DNA链的酶。 三、基因克隆的质粒载体 1．载体 载体是指一种可将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。前者是克隆载体，后者称为表达载体，常用的克隆载体可分为3类，即质粒、噬菌体及病毒。 2．质粒 一些在细菌中独立存在于其染色体之外的，能够自主复制的小型双链环状DNA分子，只有酵母中的杀伤质粒是RNA分子。作为高质量的克隆载体的质粒必须具有如下特性： （1）具有复制起点，在一般情况下，一个质粒只有一个复制起点。 （2）携带易于筛选的选择标记，以便为宿主细胞提供易于检测的表型作为选择记号。 （3）具有多种限制酶的单一识别位点，以供外源基因的插入。 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。 （5）有安全性，即作为克隆载体应当只存在有限范围的宿主，在体内不进行重组，不会发生转移，不产生有害性状，不会离开宿主而自由扩散等。 四、重组DNA的基本步骤 1．获得目的基因 目的基因的获得途径： （1）限制性内切酶酶切产生待克隆的DNA片段（包括鸟枪法）； （2）人工合成DNA； （3）反转录酶酶促合成法； （4）PCR扩增特定的基因片段。 2.DNA分子的体外重组 重组DNA分子是指外源DNA（目的基因）用DNA连接酶在体外连接到载体后重新组合而成的DNA。 体外重组连接的常用方法有： （1）黏性末端连接法 选择同一种（或2种）限制酶消化载体和外源D