基因工程制药技术.pptx

第一页，共一百六十四页。 重组DNA技术是在分子水平对基因进行体外操作，因而也称为分子克隆(molecular cloning)或基因克隆。 所谓克隆(clone)：是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。第二页，共一百六十四页。分子克隆：是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新得遗传特征的过程基因工程：利用分子克隆技术来操作目的基因，并改变生物的遗传性状的过程就称为基因工程。第三页，共一百六十四页。第四页，共一百六十四页。基因工程最基本的必备的材料：工具酶 载体目的基因原核或真核宿主细胞第五页，共一百六十四页。分子克隆的基本过程:分：得到目的基因切：将目的基因和载体用适当的限制性内切酶切割接：将目的基因和载体连接，形成重组子转：将重组子转到适当的宿主细胞中筛：筛选出含正确重组子的宿主细胞，扩增第六页，共一百六十四页。第一节? 基因工程中常用工具酶第七页，共一百六十四页。工具酶分类使核酸降解的核酸酶类：核酸内切酶、核酸外切酶催化核酸合成的酶类：DNA聚合酶，RNA聚合酶，连接酶，逆转录酶核酸修饰酶类：甲基化酶，激酶，基团转移酶， 磷酸酶等第八页，共一百六十四页。一、 限制性核酸内切酶概念的提出及背景： 30年代初，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染（“细菌免疫”）。 限制现象（限制性内切酶） 修饰现象（甲基化酶） 1962年W. Arber提出；菌体中含有2种以上功能不同的酶： 核酸内切酶（限制） DNA甲基化酶 （修饰）第九页，共一百六十四页。限制性核酸内切酶(restriction endonuclease，RE) 是由细菌自己产生的一种能识别双链DNA中的特定序列，并以内切方式水解核酸中磷酸二酯键的核酸内切酶。第十页，共一百六十四页。1．限制性核酸内切酶的分类：I型RE： 由三种不同的亚基组成。需Mg++，S-腺苷甲硫氨酸（SAM），ATP为辅助因子；识别位点复杂，特异性差。通常在识别位点的400~7000bp范围内切割DNA。现已报道19种。第十一页，共一百六十四页。Ⅲ型RE；由两种亚基组成。需Mg++，ATP为辅助因子；切割位点靠近识别序列但较难预测。一般在25~27bp范围内切割。现已报道4种。I、Ⅲ型RE酶同时具有限制(剪切)与修饰(甲基化)两种功能并依赖于ATP，切割DNA链的位置远离识别序列，因此I型和Ⅲ型酶在DNA重组技术中都不常用。第十二页，共一百六十四页。Ⅱ型RE实际应用价值最大，这是因为：①Ⅱ型酶只具有限制性活性，无甲基化修饰活性；② 对DNA的切割要求严格的序列作为靶位点，切割精确；③ 此类酶作用时只需Mg2+参与，无需ATP。 因此Ⅱ型限制性核酸内切酶是基因工程中剪切DNA分子的常用工具酶，被誉为“分子生物学家的手术刀”。第十三页，共一百六十四页。2．限制性内切酶的命名 目前已广泛采用Smith和Nathams于1973年提出的命名系统：限制性内切酶第1个大写字母：来自细菌的属名(genus)，第2、3个小写字母：来自种名(species)，第四个字母代表菌株(strain)第十四页，共一百六十四页。3．Ⅱ型限制性内切酶的作用特点：被分子生物学家广泛研究应用，现已发现有200多种识别序列的REMW=60KD的单链多肽最适pH：6~8NaCl有抑制作用，Mg2+ 激活，巯基有保护作用热不稳定。第十五页，共一百六十四页。作用特点：有严格的识别、切割的DNA序列，并以内切的方式水解双链DNA中的磷酸二酯键。识别序列一般为4～6个碱基对。 切割靶序列的大小决定了切割DNA链后产生的DNA片段的长短切割后产生平头或粘性末端。只需Mg2+，不需ATP。第十六页，共一百六十四页。4. Ⅱ型酶切割dsDNA可产生两种不同的切口1. 平头末端(blunt end) 即在识别序列的对称轴上进行切割；2. 粘性末端(cohesive end) 即在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生末端带有单链尾巴的切口。根据突出端不同分为：5’粘性末端和3’粘性末端。第十七页，共一百六十四页。Ⅱ型酶切割dsDNA产生的两种不同的切口第十八页，共一百六十四页。第十九页，共一百六十四页。5. 三类特殊性质的Ⅱ型限制性内切酶：同裂酶(isoschizomer)：又称源同异工酶，即识别位点相同，但切割位点可以相同，也可以不同，例如Sam I(CCC↓GGG)和Xma I(C↓CCGGG) 第二十页，共一百六十四页。同尾酶(isocaudarmer)：不同来源的酶其识别和切割序列有一定的相关性，作用后能产生相同的粘性末端。Sau3A IBamH I GATC GGATCC CTAG C