《基因组学》第03章 物理图绘制.pptVIP

载体制备与插入DNA连接 1) YAC载体 制备过程与一般质粒载体相同 2) BAC载体 低拷贝载体,大量制备, 超离心纯化 3) 酶切 释放接头, 接头去磷, 减少自连 4) 连接(方法1) 将含有大分子DNA的琼脂糖薄片与载体混合, 按重量比1:1. 680C保温 5 min, 降温至370C, 加入连接酶过夜. 5) 连接(方法2) 将含有大分子DNA的琼脂糖薄片680C保温 5 min, 降温至370C, 加入agarase消化. 然后取出部分DNA样品,按重量比1:1加入载体, 加入连接酶过夜. 除去未连接载体 YAC转化 1) 酵母原质体的制备 采用蜗牛酶(lyticase)处理酵母细胞脱壁, 酵母 原质体保温在渗透压缓冲液中. 2) 转化酵母原质体 加入YAC连接载体, 200C保温过夜. 3) 筛选培养基 酵母基本培养基, 缺少URA,色氨酸和腺苷酸. 4) 铺板 将转化处理的酵母原质体悬浮在渗透压选择液 化培养基中迅速铺板. 5) 300C培养4-5天, 出现白色克隆为阳性克隆. YAC克隆检测---大分子DNA Southern杂交 YAC克隆的优缺点 1) 优点: 容量大, 插入片段可达1000 kb. 2) 缺点: 转化效率