中国农业大学本科生“URP”立项申请书.docxVIP

中国农业大学 本科生“URP”立项申请书 项目名称 制动应激对妊娠母鼠下丘脑GnRH蛋白的影响 申请人 王子旭 工作单位 动物医学院 联系电话 电子信箱 填表日期 2018418中国农业大学教务处制 项目名称 制动应激对妊娠母鼠下丘脑GnRH蛋白的影响 项目起止时间 项目申请人情况二、实施计划及方案（明确各个环节对培养学生创新能力的具体思路及考核办法） 姓名 王子旭 性别 女 出生日期 1964.3 最后学 历与学 硕士 专业技术 职务 高级实验师 从事专业 基础兽医学 ：熟悉实验室环境，摸索实验方法，查阅国内外参考文献，进 行理论知识巩固提高。提交一篇综述性文章。翻译一篇与本项目相关的外文文 献。培养学生的专业外语能力。 ：进行实验内容。 （1）实验动物的饲养和取材：培养学生的准备工作能力，包括小鼠的饲养、 配种方法和小鼠的解剖结构认知。 50日龄雌性ICR小鼠30只，雄性ICR小鼠10只，于试验动物房中饲养， 饲喂鼠全价料，自由采食与饮水（白开水）。光照：黑暗=14h:10h。鼠房内温度 保持在22℃。小鼠进入实验动物房适应一周以后，每天下午4点左右开始做阴 道涂片，确定发情后进行配种，次日7:30左右观察雌鼠阴道口是否有阴栓，确 定怀孕后将30只小鼠随机分成2组，每组15只，一组进行制动应激，一组对 照处理，分别在妊娠5d进行取材，各取5只小鼠的下丘脑、垂体和肾上腺进行 -80℃冻存。 （2）相关蛋白的检测：该阶段进一步培养学生的实验室操作技能，甚至研究 方法的探索和创新，培养学生严谨的科研态度。 提取组织内蛋白： 将下丘脑组织取出，与蛋白裂解液进行1： 10的比例进行组织匀浆，匀浆 完之后，静置20min,待裂解完全后，14000g,离心15min。吸取上清于另一干 净的EP管中。 蛋白浓度的测定： .样品稀释液的制备5倍稀释10piL的原液+40匹的蛋白裂解液； .稀释液的量吸取稀释液中25mL; .BCA工作液的配制 根据样品的数量（n）混合适量的AB液A:B=50：1配的量为n+1的量 A 液 200pL* （n+1） X混合 每个样品孔200piL B 液 4pL* （n+1） / .温箱37℃孵育30分钟 .570nm测吸光值（注意各个参数的设定） .测三次吸光值，求平均值 .所测蛋白的浓度：5*（ 1.0097*mean+0.0337） 煮样： .总体积：每次加样量（自己定）*次数（自己定） .原液体积：总体积*设定浓度（所测蛋白浓度的最低浓度）/蛋白浓度 .5*SDS的体积：总体积/5 .RIPA的体积：总体积-5*SDS的体积-原液的体积 .离心：1000 转 2min .在沸水中煮3min混匀，将样品放入-20℃待测。 然后进行下列步骤： .清洗玻璃板：在自来水中将玻璃板用洗洁精洗干净，不要有挂壁现象，再 在自来水中涮洗一遍，在蒸镭水中再清洗一次，浸泡一段时间后放入烘箱烘干; .装置安装：短板在内，长板在外，对齐将夹子拧到相应位置（1.5的板对准 1.5』的板对准1）加入蒸镭水，若液面下降过快，则重新安装装置，若无明显 漏液，则等十分钟进行观察，若无漏液则加分离胶； .配胶此步骤可以在检漏时进行，分离胶分为8%、10%、12%三种常用的， 分子量越大配胶浓度越小，一般分子量在40以上的可以用8%的，20-40的可以 用10%的，20以下可用12%的。分离胶和浓缩胶的成分一样，只是各个组分加 入的量不一样，可以一起配。（分离胶：H2O、30%Acryamide（丙烯酰胺）、1.5M TrisHCl（pH8.8） 10%SDS 10% AP （过硫酸镂）、TEMED。浓缩胶：H2O 30% Acryamide（丙烯酰胺）、l.OMTrisHCl （pH6.8）＞ 10% SDS、10% AP （过硫酸镂）、 TEMED）,组份的后两种容易使胶凝固，可以暂时不用加，等到往装置中加胶 时进行添加。 .灌胶等到检漏结束后，将蒸储水倒掉，用lOOOpL的枪加分离胶，动作要 迅速，但不能有气泡，枪头与平面的夹角要小，枪头紧贴长板，使胶充分加入 板槽中，加到黄色夹子上方大约2厘米处为止，然后加满蒸储水（目的：将分 离胶压平，赶走气泡），加蒸储水时也要保持枪头与水平面的小夹角，不要猛加, 防止冲坏分离胶造成弯曲，待胶凝固20-30分钟，看到与水面有一条明显的分 界线时，将蒸谯水倒掉，配好浓缩胶，加入浓缩胶（注意要点同分离胶，），插 上梳子（注意对应板用对应的梳子，毛面朝短板，光面朝长板），注意梳齿底部 不能有气泡，等大约20-30分钟，即可拔梳子加样，若此时不加样，不要拔梳 子，将装置打开放入电泳槽，加入电泳液放入4℃冰箱； .加样加的样是煮好的样，按照原来设定的加样量加样，确保样都加入梳槽 内，marker加5pL