细胞融合实验报告.docxVIP

聚乙二醇介导的细胞融合  2012年2月19星期一 陈倩倩（ 118627140313）同作者：郑梦璐 谢雨后 赵松 1、文摘 细胞能不受种属的局限可实现种间生物体细胞的融合 ,使远缘杂交成为可能 ,因而是改造细胞遗传物质的有力手段。它的意义在于从此打破了仅仅依赖有性杂交重组基因创造新种的界限 , 扩大了遗传物质的重组范围。 但融合后获得的杂种细胞具有染色体异倍性 ,致使细胞株的遗传性不稳定、植株不育性、畸形、生育迟缓等不符合育种要 求的性状出现 ,直接利用杂种细胞作育种材料目前还有许多障碍。 细胞融合技术避免了分离、提纯、剪切、拼接等基因操作 , 在技术和仪器设备上的要求不像基因工程那样复杂 ,投资少 ,有利于广泛开展研究和推广 ,有着重大的实践意义 ,正得到科学界的日益重视。 自从 20世纪 70年代 Kao和Michayluk用聚乙二醇 ( PEG, polyethyleneglycol) 诱导大麦、大豆等植物原生质体融合后 PEG 法诱导细胞融合以其容易制备、活性稳定、不需要特别的仪器 设备、操作简便等优点 , 被普遍地应用于生物、遗传、医药等研 究领域 . 高体积分数、高相对分子质量的 PEG会对细胞产生毒性 , 是限制其被广泛应用的瓶颈 , 此外 ,由于该方法涉及的影响因素较多, 进一步加大了获得理想细胞融合率的难度 .本实验主要研究PEG的浓度和细胞浓度对细胞融合率的影响。 2、背景介绍 细胞融合现象最初是在动物细胞中发现的。 1958年日本学者阅田善雄用紫外光灭活的仙台病毒在体外诱导艾氏腹水红纲 胞相互融合。 1965年他和 Harris等在此基础上各自分别采用灭活的仙台病毒 ,诱导产主了第一个种间融合并培养成活。一年后Yerganzan又进一步使用仙台病毒获得了能够增殖的杂种细胞。 后来 Littlefield 用缺陷型细胞 HGPRT-XTK-细胞杂交 ,用HAT 选择培 养基选出杂种细胞 ,开创了细胞工程的新纪元 ,继而推动了整个生物工程的发展。 1975年英国科学家 Milestein 和Kohler在体细胞杂 交基础上创立了 B淋巴细胞杂交瘤技术 ,他们将在体外不能长期 生存的经绵羊红细胞免疫过的小鼠脾细胞（ B淋巴细胞）与在体外能迅速增殖的小鼠骨髓溜细胞在聚乙二醇（ PEG）或汕台病毒的作用下融合而产生杂交瘤细胞 ,所得杂交瘤细咆承袭了两种亲 代细胞的遗传特性 ,既保存了瘤细胞在体外迅速增殖传代的能力 , 又继承了免疫细胞合成和分泌的能力 ,即能分泌抗绵羊红细胞的 抗体。该技术被誉为免疫学的一次革命其创建者荣获 1984年诺贝尔医学和生理学奖。 B细胞杂交瘤可在体外大量培养 ,也可接种到小鼠腹腔中繁 殖。自 1975年以来 ,世界各国科学家采用 B细胞杂交瘤技术已制 备出万余种单抗 ,其中绝大部分为小鼠墓抗。所谓单抗就是指培养单个杂交瘤细胞使之无性生殖形成细胞集落（称为克隆） ,由这些细胞所产生的只能识别和对付一种抗原的特导性抗体就称 为单克隆抗体 ,即单抗。 单抗于八十年代处已领尤商品化，现已有百余种诊断试剂 和数种治疗剂投放市场。目前 ,单抗新兴产业正在形成。随着 B 淋巴细胞杂交瘤技术的建立和发展 ,B淋巴细抱杂交瘤技术也发 展起来了。 早在 1977年就有 T细胞杂交瘤的报道 ,但有功能的、能分泌各种因子的 T细胞杂交瘤的报道则始于 1978年,如抗原特异的抑制因子 ,制造 T细胞杂交瘤技术的基本操作过程和 B细咆杂交瘤技术相似 ,只是用于融合的细胞是激活或抗原致敏的 T 细胞和酶缺陷型的淋巴瘤细胞。目前 ,由于技术上的限制 ,T 细胞杂交瘤 还未能发挥其固有的潜能 ,所以 ,虽然这项技术开展的时间不短 ,但收到的成效却不如 B细胞杂交瘤那么显著 . 最近研究表明 ,细胞融合与病毒和细胞之间的融合以及细胞 内的膜泡融合有许多相似之处 , 即带包被的病毒 ( 或细胞) 通过转膜病毒蛋白介导与宿主细胞的细胞膜进行融合。 I 类病毒融合蛋白包括流感病毒红血球凝集素 ( HA) 和人类免疫缺陷病毒包被蛋白,它们都具有相似的结构域 , 即都具有 a- 螺旋结构。病毒和细胞之间正是通过这些蛋白来完成融合过程 ( 伴随有构象的变化 ) 的。细胞内的膜泡融合也是如此 , 其相关融合蛋白包括 GTPases 及SNARE家族。因此推测细胞融合采用相似的机理。然而细胞融 合蛋白并不全具有 a- 螺旋结构 , 提示 a- 螺旋并非融合所必需。 3、材料和方法 3.1材料 ? 用Alsver液悬浮的鸡血细胞 ? Alsver溶液， ? 0.85% 的生理盐水， ? GKN溶液， ? 50% 的聚乙二醇溶液3.2工具和仪器 ? 盖玻片，载玻片，离心管，试管，吸