DB21T 3717—2023李、杏品种鉴定 SSR分子标记法.docx

ICS 65.020.20 CCS B 05 辽 宁 省 地 21 方 标 准 DB21/T 3717—2023 李、杏品种鉴定 SSR 分子标记法 2023 - 04 - 30 发布 2023 - 05 - 30 实施 辽宁省市场监督管理局 发 布 I DB21/T 3717—2023 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口管理。 本文件起草单位：辽宁省果树科学研究所。 本文件主要起草人：刘硕、刘宁、刘威生、章秋平、张玉萍、马小雪、张玉君、徐铭、赵海娟、刘 家成。 本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈， 我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。 归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅(沈阳市和平区太原北街2号)，联系电话：024 文件起草单位通讯地址：辽宁省果树科学研究所 (辽宁省营口市鲅鱼圈区熊岳镇铁东街) ，联系电 话：0417-7033462。 1 DB21/T 3717—2023 李、杏品种鉴定 SSR 分子标记法 1 范围 本文件规定了利用简单重复序列 (Simple sequence repeats，SSR) 分子标记法进行李 (Plum) 、 杏 (Apricot) 品种鉴定的主要仪器设备与试剂耗材、试剂配制、参照种质、操作步骤、基因型对比、 结果判定等要求。 本文件适用于利用SSR分子标记指纹对比快速鉴定李、杏种质资源。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本 (包括所有的修改单) 适用于本 文件。 GB/T 19557.1 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 总则 GB/T 19557.30 植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南 梨 GB/T 30988 多酚类植物基因组 DNA 提取纯化及测试方法 GB/T 30989-2014 高通量基因测序技术规程 GB/T 37870 个体鉴定的高通量测序方法 NY/T 2594 植物品种鉴定 DNA 分子标记法 总则 3 术语和定义 NY/T 2594界定的术语和定义适用于本文件。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp: 碱基对 (Base pair) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 (Cetyltrimethylammonium ammonium bromide) dd H2O：重蒸馏水 (Distilled and deionized water) DNA：脱氧核糖核酸 (Deoxyribonucleic acid) Hi-Di：去离子甲酰胺 (Highly deionized formamide) nt：碱基 (Nucleotide) PCR：多聚酶链式反应 (Polymerase chain reaction) PVP：聚乙烯吡咯烷酮 (Polyvinyl pyrrolidone) TE：Tris-EDTA 缓冲液 (10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0) 5 原理 2 DB21/T 3717—2023 李、杏的不同种质资源，其基因组存在着能够进行稳定遗传的简单重复序列SSR的重复次数差异。 这种差异可以通过从抽取具有代表性的检测样品种提取DNA，利用SSR引物进行扩增和电泳，通过检测其 扩增产物片段大小加以区分。 6 主要仪器设备与试剂耗材 高速离心机、分光光度计等主要仪器设备，氯仿、异戊醇等试剂，移液枪配套枪头、枪头盒等耗材， 具体见附录A。 7 试剂配制 试剂配制方法见附录B。 8 SSR 引物 用于李、杏品种鉴定的优异SSR引物有45对，见附录C。退火温度55℃-57℃。 9 参照品种 参照品种见附录D。 10 操作步骤 10.1 样品准备 受检及参照李、杏品种样品均采集幼嫩叶片，按照GB/T 30988-2014，8 提取步骤改良。每份待测 品种和参照品种选取 3 个单株进行混合分析。于春季分别自每个样株上采集新鲜、幼嫩、健康的叶片两 片 (约 1g) 混合置于离心管，做好标记置于液氮中浸泡后，保存于-80℃冰箱。 10.2 DNA 提取 采用改良CTAB法提取李、杏样品DNA；或利用植物基因组DNA提取试剂盒依照说明书进行提取。在通 风环境或通风橱进行提取。改良CTAB法DNA提取步骤如下： a) 将液氮冷冻后的叶片样品放入研钵中磨成粉