《猪萨佩罗病毒检测技术规程》.pdfVIP

DB32/T XXXX—2019 前  言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位：江苏省农业科学院。 本标准主要起草人：李彬、范宝超、孙杰、何孔旺、郭容利、周金柱、俞正玉。 I DB32/T XXXX—2019 猪萨佩罗病毒检测技术 1 范围 本标准规定了猪萨佩罗病毒的核酸检测 （RT-PCR法）、血清学检测 （间接ELISA方法）等要求。 本标准规定的RT-PCR法适用于本病毒的抗原确诊，间接ELISA试验适用于血清学的普查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修订单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 动物疫病实验室检验采样方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 猪萨佩罗病毒 Porcine Sapelovirus （PSV） 单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科萨佩罗病毒属。该病毒能引起中度或严重的神经系统紊乱、 腹泻、繁殖障碍和肺炎，感染猪康复后仍然会继续排毒，成为重要的病毒传播源，因此该病毒在猪群中 感染率很高，严重威胁着养猪业的健康发展。 4 核酸检测 （RT-PCR 法） 4.1 材料准备 PCR 引 物 P1 5`- GAGAAGGTAAAGATGGGCAAAAC - 3` 和 P2 5`- AATACAGGATGACACAGGAAGGG- 3` （见附录B）。PCR相关试剂。猪萨佩罗病毒阳性病料RNA提 取物反转录为cDNA作为阳性对照，水作为阴性对照。高速离心机 （10000r/min）、PCR仪、电泳仪、 水平电泳槽凝胶成像系统 （或紫外投射仪）、移液器等仪器。 4.2 操作步骤 4.2.1 DNA模板制备 按NY/T 541规定的方法，采集待检猪的病料置于-20℃以下冰箱保存。临床组织病料样品加入1×PBS 缓冲液进行充分研磨后冻融3次，高速10000r/min离心5min，取上清提取病毒总RNA （参照RNA提取试 剂盒说明书），并反转录成cDNA （利用反转录试剂盒），保存备用。 4.2.2 PCR 1 DB32/T XXXX—2019 PCR反应体系：2xTaqMaster Mix 12.5μL，P1 （20pmol/μL）1.0 μL，P2 （20pmol/μL）1.0 μL，模 板2 μL～5μL，加ddH2O至总体积 25 μL。反应条件：预变性94℃ 5min，94℃30s，扩增的退火温度分 别采用55℃进行扩增30 s，72℃30 s， 35个循环72℃延伸10min。 4.2.3 电泳 制备1%琼脂糖凝胶，内加适量溴化乙锭或其替代物，取PCR产物10 μL ～ 20 μL分别与适量加样 缓冲液混合后，加样到电泳孔中，9V/cm恒压下电泳15min～30min。将电泳好的凝胶放到紫外投射仪 或凝胶成像系统上观察结果。 4.3 结果判定 阳性对照扩增到689bp条带，同时阴性对照无条带时，试验成立。 在试验结果成立的前提下，如果样品扩增到689bp条带，可确认为样品为猪萨佩罗病毒PCR阳性。 4.4 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物，应做好无害化处理，检测过程中防止交叉污染的措施见附录A。 5 血清学检测 （间接ELISA 方法） 5.1 材料准备 猪萨佩罗病毒重组3