第一课外源基因在大肠杆菌中的表达原理及微量移液器的使用.ppt

第一页，共二十七页，2022年，8月28日 第一课 第一部分 外源基因在大肠杆菌中的表达原理 第二部分 微量移液器的使用 臧 宇 辉 生科楼A432房间 Tel:o) Email:zangyh@nju.edu.cn 第二页，共二十七页，2022年，8月28日 第一部分 外源基因在大肠杆菌中的表达原理 研究者经常需要获得大量的蛋白质以满足各类研究的需要。比如： 1，用作抗原来刺激抗体的产生：可以是蛋白质或其部分片断。 2，用于生化和细胞生物学研究：这种情况下保持蛋白质原有的功能（如高比活性酶、结合蛋白或生长因子）就显得十分重要。 3，用于结构研究：要求得到的蛋白质有天然的结构。因为几乎不可能知道一种尚未知道其结构的蛋白质经变性后是否被精确地重折叠，蛋白质必须以可溶性形式产生。 第三页，共二十七页，2022年，8月28日 获得目的蛋白的方法： 从天然产物中纯化 利用基因工程方法表达 基因工程蛋白质表达的概念： 是指为了获取大量的目标蛋白而进行的有目的的蛋白质合成。 方法是将编码所需蛋白质的基因插入质粒或其他载体，然后再将载体导入活细胞。利用宿主细胞的蛋白质生产体系产生目的蛋白。 第四页，共二十七页，2022年，8月28日 The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1978 for the discovery of restriction enzymes and their application to problems of molecular genetics Werner Arber Daniel Nathans Hamilton O. Smith ??? ??? ??? Switzerland Biozentrum der Universit?t  Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA Johns Hopkins University School of Medicine Baltimore, USA 1929 - 1928 - 1999 1931 - 第五页，共二十七页，2022年，8月28日 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 启始复制子（ori, Origin of replication)； 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 质粒的结构： 第六页，共二十七页，2022年，8月28日 第七页，共二十七页，2022年，8月28日 第八页，共二十七页，2022年，8月28日 重组DNA转化细菌过程示意图 第九页，共二十七页，2022年，8月28日 第十页，共二十七页，2022年，8月28日 各种表达系统 原核表达系统：指大肠杆菌表达系统。 真核细胞系统包括：哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞、植物细胞等表达体系。各种表达体系各有优缺点。举例说明如下： 原核表达系统 大肠杆菌表达载体：包括噬菌体载体和质粒载体，通过感染或转化大肠杆菌产生目的蛋白。 原核细胞系统主要是利用大肠杆菌细胞生产目的蛋白。 优点：该系统操作简便、周期短、收益大、及表达产物稳定。 局限：表达基因的相对分子质量有限，且不能对表达产物进行一些翻译后加工 、修饰。 第十一页，共二十七页，2022年，8月28日 各种表达系统 杆状病毒表达系统 将外源基因插入昆虫杆状病毒，通过重组病毒感染昆虫细胞而产生目的蛋白。 优点：表达效率高，昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近。 缺点：操作比较繁琐。 第十二页，共二十七页，2022年，8月28日 各种表达系统 哺乳动物细胞表达系统 利用病毒、质粒建立重组有外源基因的表达载体，通过感染或转染进入宿主细胞表达目的蛋白。 优势：能够指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的糖基化等多种翻译后加工功能，因而表达产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的哺乳动物蛋白质分子。 缺点：表达效率通常不高。 第十三页，共二十七页，2022年，8月28日 利用大肠杆菌进行外源基因表达的过程 构建表达载体 在大肠杆菌里表达外源基因一般是始于将基因插入表达载体（通常为质粒）。表达载体应具有的几种元件是： 选择标志的编码序列，它可提供筛选以确定载体是否进入了宿主细胞。 转录调控序列：可调控的强启动子（如lac, tr或tac启动子），经诱导后可产生大量的目的基因mRNA；转录终止子。 翻译调控序列：一个位置合适的