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T载体连接获得重组DNA实验报告
实验概述： 本次实验旨在通过将外源基因序列插入至载体DNA（T载体）中，再通过细胞转化技术使其进入宿主细胞，从而进行外源基因在宿主细胞内的表达研究。 实验步骤： 1. 在E.coli DH5α菌液中，经过料浆的制备与DNA提取，获得纯化后的T载体DNA和外源基因DNA。 2. 执行连接操作。将切割后的T载体DNA和外源基因DNA加入连接酶，在40℃恒温水浴中进行酶切反应。反应后的产物进行膜过滤纯化。 3. 进行转化操作。将纯化后的DNA溶于CaCl2，冷冻后，加入底物菌，经恢复实验后在LB培养基上进行高温抗性筛选。 4. PCR扩增。通过PCR技术对菌株中是否含有重组T载体（带有外源基因）进行检测和鉴定。 5. 获得理论目的的克隆，通过繁殖和扩展使其获得产物。 实验结果： 在实验中， 已成功地构建并转化了重组大肠杆菌DH5α,进一步验证了连接产物的成功性，在PCR扩增中发现， 菌株中含有重组T载体。 表明DNA转化实验获得了成功。 实验反思： 1. 在连接酶切反应中，应注意不同限制性内切酶所切割的DNA末端特性不同，可能会影响连接效果。因此，对于酶切产物的分析结构尤为重要。 2. 底物菌转化实验时，应注意工作台、培养皿、洗涤瓶等器具的高温灭菌消毒，以避免底物菌受到其他致病菌的干扰，从而有效纯化出重组大肠杆菌。（摘自《微生物实验技术》） 参考文献： 1.程程, 白翔. T载DNA连接重组技术的研究[J]. 科技创新与创业教育, 2020 (02): 60-63. 2.薛卫红, 朱浩洋, 尹前进,王蓝芹.T载质粒的构建[J]. 医师进修杂志, 2014, 19(06): 270-271. 3.王路路, 王鹏飞. 外源基因的T载体连接重组技术研究进展[J]. 实用医学杂志, 2018, 34(08): 1389-1392. 4.郭晓华, 章奕程, 尹博,张占宇. T载体连接法构建β-萘乙酸羧化酶基因重组质粒的研究[J]. 中国医学创新, 2018, 15(27):169-173. 5. 贺可雯.外源基因的T载体连接及其在分子生物学中的应用 [D]. 沈阳: 沈阳工业大学,2019.
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