DB64 1270_2016  稻瘟病病菌生理小种鉴定技术规范.docx

ICS 65.020.20 B15 DB64 宁 夏 回 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 64/ T1270—2016 稻瘟病病菌生理小种鉴定技术规范 Rule for Identificating Physiologic Race of Magnaporthe oryzae 2016-12-28发布 2 0 1 7 - 0 3 - 2 8 实 施 宁夏回族自治区质量技术监督局 发布 I DB64/ T1270—2016 前 言 本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009 《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。 本标准由宁夏回族自治区农林科学研究院提出。 本标准由宁夏回族自治区农牧厅归口。 本标准起草单位：宁夏农林科院农作物研究所、宁夏大学农学院、宁夏种子工作站。 本标准起草人：史延丽、刘炜、李文强、李玉红、沙蓉。 1 DB64/ T1270—2016 稻瘟病病菌生理小种鉴定技术规范 1 范围 本标准规定了稻瘟病菌 (Magnaporthe oryzae)生理小种鉴定的术语和定义、鉴别寄主选择、育苗、 病菌采样、分离、培养、接种、保湿培养、调查记载方法及抗性评价等技术规范。 本标准适用于宁夏稻瘟病菌生理小种鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 稻瘟病 由稻梨孢真菌引起的一种水稻病害，又称稻热病、火烧瘟、叩头瘟。病菌侵染叶片、茎秆、穗颈、 小穗梗和谷粒。根据受害时期和侵染部位不同，可分别引起苗瘟、叶瘟、节瘟、穗颈瘟和粒瘟。 2.2 鉴别寄主 由一系列品种组成，并根据小种在其上的反应能够区分病原菌群体中的不同小种。 2.3 单孢分离法 由小段顶端菌丝或单个孢子繁殖来获得纯菌种的方法。 2.4 生理小种 同种病原物的不同群体在形态上没有什么差别，在生理生化特性、培养性状、致病性等方面存在差 异的生物型或生物型群。 3 鉴定方法和材料 3.1 样品采集 3.1.1 病圃设置 病圃田设在稻瘟病常发病区或常年稻区，平坦地势低、土壤肥沃、肥力均匀、排灌方便，利于稻瘟 病发生。 2 DB64/ T1270—2016 3.1.2 标样采集和保存 采集各稻区病穗颈和病穗节，统一编号，晾干，置于密闭容器，4℃冰箱内保存、备用。 3.2 病菌分离保存 3.2.1 标本保湿培养 将标本放置含有抗生素利福平2ml(25mg/ml 酒精稀释配液)的无菌水中，浸泡10h～24h,取出 后放置在灭菌标本支架上，标本支架放入两张浸有抗生素无菌水滤纸的培养皿，保湿培养48h～72h。 3.2.2 单孢分离 经保湿培养的标本用震落法，将孢子震落到灭菌水琼脂培养基中，水琼脂培养皿放入26℃恒温培 养箱，培养16h～20h。 水琼脂培养基：琼脂粉20g, 利福平2ml(25mg/ml 酒精稀释配液),水1000ml。 3.2.3 单孢提纯 在超净工作台上显微镜下用手术刀挑取琼脂培养基上的稻瘟病单孢，接种到PDA 培养基上， 一个 标本上抖落的单孢至少要挑取3个，并在培养皿上标明编号，在26℃恒温培养箱中培养3d-5d, 观察 菌落生长情况，每个PDA 培养基上可以接种3-5个单孢。马铃薯琼脂培养基(简称 PDA): 成品 PDA 培养基粉40g,水1000ml。 3.2.4 单孢保存 当单孢菌株的菌落直径达到2cm 时，用灭菌手术刀切取一部分转入到灭菌稻谷粉培养基中，每皿 倒2/3培养基，每皿接种一株单孢菌株。待菌落长满培养皿直至自然干燥，在无菌条件下切碎装入冻 存管， -20℃低温保存。稻谷粉培养基：稻谷粉20g, 琼脂粉20g, 酵母粉2g,利福平2ml(25mg/ml 酒精稀释配液),水1000ml。 3.3 接种体准备 3.3.1 病菌活化 将保存的单孢菌株取出一小块，放在PDA 培养基中在26℃的恒温培养箱中进行菌株活化，需3d~ 5d。 3.3.2 病菌扩繁培养 将 PDA 培养基中的菌株在超净工作台中转入产孢培养基中，在26℃的恒温培养箱中全黑暗培养 5d～7d。 产孢培养基：玉米粉40g, 稻谷粉50g, 琼脂粉20g, 水1000ml。 3.3.3 孢子产生 将产孢培养皿置于黑光灯下(荧光灯与培养皿距离38cm)、 黑暗和光照交替12h, 4d～7d, 促进 菌株产生孢子。 3.3.4 孢子悬浮液制备 用无菌水洗下产孢培养基表面的孢子，用灭菌纱布过滤，加入0.02%的 tween 20