肿瘤基因突变检测——高通量测序技术规范.docx

肿瘤基因突变检测——高通量测序技术规范 范围 规定了肿瘤高通量测序检测技术的原理、生物安全要求、材料与试剂、样本、检测、数据处理、质量控制、结果判定与表述、检测报告、废弃物处理与防止污染的措施。 本标准适用于使高通量测序检测技术检测石蜡样本/血液/胸腹水等样本中的肿瘤相关基因变异。 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T1193-2003 基因检验实验室技术要求 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 NGS：高通量测序（Nextgeneration Sequencing） ctDNA：循环肿瘤脱氧核糖核酸（Circulating Tumor Deoxyribo Nucleic Acid） FFPE：福尔马林固定石蜡包埋组织（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded） NTC：无模板对照（No Template Control） cPAS：联合探针锚定聚合测序（combinatorial Probe Anchor Synthesis） 生物安全要求 采样及检测过程所涉及的实验操作应按 GB 19489 规定执行。 材料与试剂 仪器与耗材 II级生物安全柜。 涡旋混合仪。 恒温加热器（56℃～90℃可调）。 恒温水浴锅（可达 60℃）。 微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL 。 微量带滤芯吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。 医用冰箱：2℃～8℃、-20℃、-80℃ 。 离心机（10 mL转子，可达10000×g），可低温离心。 离心机（1.5 mL转子，可达13000×g），可低温离心。 实时荧光定量PCR仪。 离心管：200μL、1.5mL、2mL、10mL、15mL。 高通量测序仪，联合锚定探针法测序仪 生物分析仪，Agilent 2100 Bioanalyzer 微量核酸定量仪，Qubit 荧光定量仪，可检测低至10 pg/μl 的DNA 微量分光光度计和荧光分光光度计， 基因扩增仪 试剂 试剂级别：除另有规定，本方法试验用水应符合GB/T 6682规定的二级水，所用化学试剂均为分析纯。 核酸提取试剂。 荧光PCR试剂。 无水乙醇。 异丙醇。 二甲苯。 RNase A。 TE缓冲液。 SDS。 PBS。 cfDNA Binding Solution。 Dynabeads? MyOne? SILANE。 MAGMAX cell-free DNA ISO Kit。 QIAamp DNA FFPE Tissue Kit。 Qubit?dsDNA HS Assay Kit。 测序反应通用试剂盒（联合锚定探针fa2）。 样本 采集 组织样本：石蜡包埋病理组织或切片样品应确定含有肿瘤病变细胞，将石蜡包埋病理组织或切片样品切成厚度为5μm的切片，FFPE 样本的组织面积应介于0.5 cm2～1 cm2，切片用量为5 片。 外周血样本：10mL，使用streck管采集，不可使用肝素抗凝剂。 胸腹水样本：新鲜胸腹水10mL，使用streck管采集，不可使用肝素抗凝剂。 新鲜组织样本：肿瘤组织黄豆粒大小3粒以上，含福尔马林保存液保存。 保存与运输 FFPE样本保存在2℃～8℃低温运输，最长可以保存3年。 streck管血液样本、胸腹水样本避光常温运输，忌暴晒、冷冻，在室温下最多可以保存3 d。 新鲜组织样本含福尔马林保存液保存可保存1个月。 检测 在试剂准备间生物安全柜内进行以下操作： 试剂准备及体系制备 在常规样本制备间生物安全柜内进行以下操作： 组织样本机FFPE样本：刮取5片FFPE样品至1.5 mL离心管中，通过脱蜡、去除RNA、柱提法等步骤提取DNA并进行洗脱及纯化，获得DNA，待检的样品的DNA浓度为1.5～3 ng/μL； 在特殊样本制备间生物安全柜内进行以下操作： 胸腹水、血液样本通过进行离心、去除RNA、柱提法等步骤提取ctDNA并进行洗脱及纯化，获得ctDNA； 在杂交捕获间进行以下操作： 提取的全基因组DNA，设计目标检测区域的探针，进行杂交捕获，获取靶序列，通过测序及信息分析得到样本基因突变信息。 在打断间及杂交捕获间进行以下操作： 在打断间用打断仪对提取的DNA片段化，在杂交捕获间末端修复及加“A” ，连接接头，并引入Index标签构建成为测序引物可识别的的DNA文库； 在文库制备间进行以下操作： 将DNA文库与探针进行杂交，探针为标记有生物素