实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳.pptxVIP

实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳第1页/共11页 2一 实验目的 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。 自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如： DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。?第2页/共11页 3二 实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电； pH8左右时，整个分子带负电。 在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超螺旋DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。 第3页/共11页 4二 实验原理 第4页/共11页 5凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50 000~1 0000.7%琼脂糖20 000~1 0001.4%琼脂糖6 000~3004.0%聚丙烯酰胺1 000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1 凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。 第5页/共11页 6 DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间第6页/共11页 7 EB(溴化乙锭) 能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1μg. EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 在紫外线的照射下结合溴化乙锭的DNA分子发出荧光第7页/共11页 8三 实验步骤 称样溶解加热制板倒胶取样点样电泳检测第8页/共11页 9三 实验步骤 制胶 —— 1.0 ％琼脂糖凝胶 (50ml) ? 凝胶板的制备 ——小心加入2－3μlEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用） ? 点样—— 样品20μl，与4μl溴酚兰混匀 ( DNA maker 3μl 加入10μl水与4μl溴酚兰混匀) ? 电泳——稳压 80v，DNA向阳极移动, 大约50-60min ? 观察和拍照——254nm紫外灯下观察 第9页/共11页 10四 实验结果 五 注意事项 EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!!!六 习 题 琼脂糖凝胶电泳的适用范围？2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？4 泳道 maker1 泳道 质粒DNA2、3、5、6泳道 酶切产物1 2 3 4 5 6质粒酶切片段第10页/共11页 感谢您的欣赏第11页/共11页