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淋巴细胞的分离和功能检测;淋巴细胞的分离和功能检测 Separation and Assays for Lymphocytes;第一节 外周血单个核细胞的分离 外周血单个核细胞 （peripheral blood mononucler cell，PBMC):单核细胞 淋巴细胞 ; 人不同细胞的漂浮密度 红细胞：1.09~1.1 嗜酸性：1.09~1.095 嗜中性：1.080~1.085 B细胞：1.062~1.075 T细胞：1.065~1.077 NK： 1.050~1.070 单核细胞：1.050~1.066 血小板：1.030~1.060;Ficoll分层液分离法 属于单次密度梯度离心分离法 分离液组成： 聚蔗糖（商品名为Ficoll） 泛影葡胺（常用商品为isopaque、hypaque） 故又称Ficoll-hypaque分层液 ;Ficoll： 分子量：40KD 高密度 低渗透压 无毒性 使用浓度：60g/L (密度???1.020） 泛影葡胺： 使用浓度：340g/L（密度：1.200） ;Ficoll-hypaque的密度： 分离人外周淋巴细胞：1.077±0.001 分离小鼠淋巴细胞 ：1.088 分离马淋巴细胞 ：1.090 ;操作过程： 将抗凝全血以Hank’s液适当稀释后轻轻叠加在分层液上.试验尽量在低温下进行（4 ℃ ~8 ℃或冰浴）。 水平式离心（2000rpm，20min） 吸出白色云雾状单个核细胞层，洗涤3次备用 ;密度梯度分离单个核细胞（Ficoll分层液）; 细胞活性： ＞95% 单个核细胞纯度：＞95% 细胞获得率： ＞80% 最佳温度： 20℃;Percoll分离法 属于连续密度梯度离心分离法 Percoll：包有乙烯吡咯顽酮的硅胶粒 特点：渗透压低、黏度小、无毒 扩散常数低，可形成稳定的梯度;操作： Percoll原液（密度1.135）加等量磷酸缓冲液 高速离心，使分层液形成连续密度梯度 将细胞悬液叠加在分层液上，低速离心后得到四个细胞层 吸取所需细胞层，洗涤备用 ;密度梯度分离单个核细胞（ Percoll分层液）; 细胞活性：＞95% 细胞纯度： ＞98% 细胞获得率： ＞75% 最佳温度： 20℃;密度梯度离心法注意事项： 无菌操作 安全防护 注意最佳温度操作 适当稀释血液样品（稀释倍数至少1倍，但要收集血浆成分则不能稀释） ;第二节：外周血淋巴细胞的分离和纯化 外周血单个核细胞中还含有少量单核细胞，甚至还有少量红细胞和血小板，若特定试验要求应该除去这些成分. ;红细胞去除法 低渗裂解法 PBMC中加入无菌双蒸水，调节浓度至2X106，轻轻混匀45s，即刻加入等体积1.8%氯化钠，使溶液恢复等渗。; 氯化铵处理法 PBMC中加入一定量的0.83%的氯化铵溶液，轻轻震荡2分钟，即可溶解红细胞 ;血小板去除法 离心洗涤法 HBSS或PBS洗涤分离的PBMC 2-3次，可去除大部分血小板。 ;单核细胞去除法 粘附法 单核细胞37℃下能粘附在塑料或玻璃表面，淋巴细胞则不能，将PBMC置于细胞培养瓶中培养1小时，即可去除单核细胞。 淋巴细胞纯度：＞95% 活性：＞95%;L-亮氨酸甲酯法 L-亮氨酸甲酯在溶酶体酶的作用下可转化成有毒L-亮氨酸- L-亮氨酸甲酯，导致单核细胞破坏。同时可去除NK细胞和Tc细胞。 淋巴细胞纯