长白山林蛙油真伪鉴别 蛋白质指纹图谱法.pdfVIP

长白山林蛙油真伪鉴别蛋白质指纹图谱法 1 范围 本标准规定了高效液相色谱蛋白质指纹图谱法鉴别长白山林蛙油真实性的方法。 本标准适用于长白山林蛙油真实性的鉴别。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19507 地理标志产品 吉林长白山中国林蛙油 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 长白山林蛙油 changbai mountain ranae oviductus 长白山林蛙油是主产于长白山的林蛙油，即《中华人民共和国药典》 2020 版一部收载的哈蟆油， 为蛙科动物中国林蛙 Rana temporaria chensinensis David 雌蛙的输卵管，经采制干燥而得。 4 原理 根据长白山林蛙油中蛋白质组成成分的特征，建立蛋白对照指纹图谱，并以此鉴别林蛙油真伪。 5 试剂和材料 除特别说明外，所有试剂均为分析纯。 5.1 石油醚； 5.2 PBS 缓冲液 （0.1 M pH 7.4）； 5.3 硫酸铵（(NH ) SO ）； 4 2 4 5.4 盐酸胍 （CH N ∙HCl ）； 5 3 5.5 二硫苏糖醇（C H O S ，DTT ）； 4 10 2 2 5.6 三氟乙酸（C HF O ，TFA ）； 2 3 2 1 5.7 色谱乙腈（C H N ）； 2 3 5.8 水（H O ）：GB/T 6682 规定的一级水； 2 5.9 溶菌酶（纯度98% ）。 6 仪器设备 6.1 天平（感量0.00001 g ）； 6.2 粉碎机（频率：50-60 Hz ）； 6.3 20 目筛； 6.4 电热鼓风干燥箱； 6.5 具塞锥形瓶 （100 mL）； 6.6 离心管（100 mL ）； 6.7 布氏漏斗（100 mL ）； 6.8 抽滤瓶（250 mL ）； 6.9 磁力搅拌器； 6.10 冷冻离心机； 6.11 透析袋（截留分子量：8000Da）； 6.12 容量瓶（5 mL ）； 6.13 微孔滤膜（0.45 μm）； 6.14 样品瓶（1.5 mL ）； 6.15 高效液相色谱仪； 6.16 Agilent Zorbax 300 SB-C 8 色谱柱（250 ×4.6 mm, 5 μm）； 7 样品 应符合 GB/T 19507 要求的长白山林蛙油。 8 试验步骤 8.1 试样制备 使用天平（6.1 ）取林蛙油（7 ）适量，经粉碎机（6.2 ）粉碎后过 20 目筛 （6.3 ），样本置于具塞 锥形瓶（6.5 ）中经石油醚（5.1）室温搅拌脱脂 1 h ，滤过后（6.7，6.8），粉末置于电热鼓风干燥箱（6.4） 中 55 ℃ 烘干，保存备用。 8.2 供试品溶液制备 8.2.1 取试样（8.1 ）0.5 g，置于具塞锥形瓶（6.5 ）中，加 PBS 缓冲液（5.2 ）50 mL。 8.2.2 磁力搅拌器（6.9 ）连续搅拌 8 h 后，以 5000 r/min 离心（6.6，6.10 ）15 min，收集上清液。 8.2.3 向上清液（8.2.2 ）中缓慢加入硫酸铵（5.3 ）固体至 60% 饱和度。 2 8.2.4 混合物在 4 oC 静置1 h 后，以 8000 r/min 离心（6.6，6.10 ）20 min。 8.2.5 收集沉淀（8.2.4 ），使用 6 M 盐酸胍（5.4 ）（含10 mM DTT）溶解，并装入透析袋（6.11 ）在一 级