质粒的提取及检测.ppt

第一页，共二十九页，2022年，8月28日 　　　质　粒（plasmid） 是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1~n个） 　　　　　　　松弛型复制（20个以上） 第二页，共二十九页，2022年，8月28日 常用的质粒载体 是通过DNA重组技术构建而成的。pUC18, pUC19(500~700 第三页，共二十九页，2022年，8月28日 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 第四页，共二十九页，2022年，8月28日 提纯的思路 质粒的特性：共价、闭合、环状的小分子量DNA 要去除的物质： 　蛋白 　基因组DNA 　脂类及小分子杂质 　RNA 第五页，共二十九页，2022年，8月28日 　　　　质粒的检测——凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 第六页，共二十九页，2022年，8月28日 第一部分　质粒DNA的提取 第七页，共二十九页，2022年，8月28日 　一、实验目的 通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒。 第八页，共二十九页，2022年，8月28日 　二、实验原理 碱法提取主要是利用共价闭合环状质粒与线性染色质在拓扑学上的差异来分离它们，在碱性PH，DNA变性，恢复中性时，线性染色体DNA不能准确复性，与其它大分子共沉淀，而质粒DNA却可以准确复性，留在上清中。 碱性下，变性蛋白是可溶的，酸性、中性下变性蛋白不溶而沉淀。几乎所有纯化质粒的方法都用到质粒DNA分子相对较小和共价闭合环状这两个特性。由于操作原因提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。 第九页，共二十九页，2022年，8月28日 三、实验材料、器具及药品 　　 实验器具　　微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器。 实验材料 　　含PUCm-T的E. coli DH5α菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管), 离心管架。  第十页，共二十九页，2022年，8月28日 实验药品 1.LB培养基配制及分装(每升用量) 胰蛋白胨(Bacto-tryptone) 10g 酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5g NaCl 10g pH 7.5 121℃，20min 高压灭菌 　 第十一页，共二十九页，2022年，8月28日 2.溶液 溶液Ⅰ 200ml 50mmol/L 葡萄糖 1.98g 25mmol/L Tris-Cl(pH 8.0) 5ml 1M 10mmol/L EDTA(pH 8.0) 5ml 0.4M 溶液Ⅱ 0.4mol/L NaOH 2%SDS 临用前1:1混合贮存液即为II液. 溶液Ⅲ 5mol/L 醋酸钾 60ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml (最终pH4.8) 第十二页，共二十九页，2022年，8月28日 3.分离液 酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1 4.无水乙醇 5.70%乙醇 6.无菌水 第十三页，共二十九页，2022年，8月28日 各试剂的作用： 溶液I 　　作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活 溶液II 　　作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性。 溶液III 　　作用：酸性下质粒DNA复性，变性蛋白－SDS＋线性DNA沉淀，K＋可中和DNA 第十四页，共二十九页，2022年，8月28日 平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1） 　作用：氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。平衡酚pH7.8（酸性下DNA分配于有机相，酚的密度大），可使DNA在上清中。异戊醇有助于消除抽提过程中出现的泡沫） 注：用时取下层液，酚腐蚀性强，可引起灼伤。 无水乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA 第十五页，共二十九页，2022年，8月28日 　　　　四、实验步骤 接含PUC18(或pET21a)质粒