elavl1a对斑马鱼生长发育的调控作用.docxVIP

? ? elavl1a对斑马鱼生长发育的调控作用 ? ? 洪子璞，张文振，陈聪德 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院，浙江 温州 325027，1.创面外科；2.小儿外科 胚胎及出生个体的生长发育是个相当复杂的过程，涉及到多个系统及组织。其中，内分泌系统的多种激素的缺欠可以导致生长发育迟滞。斑马鱼饲养成本低，便于大规模养殖，同时由于体外受精，体外发育，且其发育周期短，透明易观察，与人类相关的84%疾病基因在斑马鱼体内均能表达[1]，正日渐成为重要的模式动物[2]。ELAVL1又名HUR，是一种可在细胞核内编码的RNA结合蛋白，在机体内全身性表达，除了对细胞增殖、分化具有重要的作用之外[3]，近期还有研究显示它可以影响肠神经系统发育[4]，也可能影响甲状腺激素及生长激素的分泌及生理作用[5-6]，以上均提示ELAVL1的表达异常将可能引起生长发育障碍。为了探究ELAVL1对个体发育及生长的影响，本文通过运用CRISP-Cas9技术定向敲除斑马鱼5个核苷酸序列，从而提前终止蛋白翻译来影响elavl1a蛋白的表达，来获得斑马鱼敲除elavl1a后生长发育迟滞的模型，并为后续探究其可能的机制做前期工作。 1 材料和方法 1.1 动物及饲养繁育材料 野生AB型斑马鱼品系（D.rerio）从国家斑马鱼资源中心购买，参照斑马鱼手册进行标准化养殖[7]。野生型和突变型胚胎在胚胎培养液（E3：0.5 mmol/L氯化钠，0.17 mmol/L氯化钾，0.33 mmol/L氯化钙，0.33 mmol/L氯化镁）中于28.5 ℃进行培育。按照10 L的水缸放置15条成鱼的标准养殖，在14 h光照、10 h黑暗的周期下，每天进行循环换水。产卵前，提前1 d将鱼按照雌雄1∶1的比例放入一个水槽中并用隔板分开，第2天灯亮后拔出隔板进行交配。2个月以上的斑马鱼通过剪尾鳍提取DNA进行基因型鉴定。 1.2 主要试剂与仪器 Taq DNA聚合酶、T7 RNA Polymerase-PlusTMEnzyme Mix、Nanodrop2000/2000C分光光度计购于美国Thermo Fisher公司，Pyrobest DNA Polymerase、dNTP购于日本TAKARA公司，DR274质粒与MLM3613质粒购于美国Addgene公司。所有引物合成和DNA序列测定均由上海迈浦生物科技有限公司进行。 1.3elavl1agRNA靶点设计 通过gRNA在线设计工具CHOPCHOP（http∶//chopchop.cbu.uib.no/）查找gRNA序列。同时在NCBI（https∶///）验证相应序列，并根据靶点设计上下游引物，送上海迈浦生物科技有限公司合成。靶点序列及上下游引物见表1。 表1 斑马鱼elavl1a敲除靶点及引物 1.4 gRNA mRNA与Cas9 mRNA合成 参照DR274质粒2～4 ng，P1 引物（10 μmol/L）1 μL，P4 引物（10 μmol/L）1 μL，pryobest DNAPolymerase缓冲液6 μL，pryobest DNA Polymerase 0.5 μL，加入适量的灭菌水至60 μL，PCR反应按照95 ℃ 30 s；35×（95 ℃ 30 s，50 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）；72 ℃ 10 min；16 ℃进行。PCR产物在1%琼脂糖胶电泳30 min，观察PCR结果。 苯酚-氯仿纯合模板DNA后参照NTP（10 mmol/L）1 μL，10×反应缓冲液2 μL，模板DNA 0.2～1 μg，T7 RNA Polymerase-PlusTMEnzyme Mix 2 μL，RNase inhibitor 1 μL，加入DEPC水至20 μL，37 ℃反应3 h。反应完成后沉淀并纯化gRNA，检测浓度后，DECP水稀释后分装存于-80 ℃冰箱。 将MLM3613质粒线性化后，参照合成gRNA mRNA方法合成Cas9 mRNA，检测浓度后，DECP水稀释后分装存于-80 ℃冰箱以备使用。 1.5 显微注射 将转录获得的gRNA与Cas9 mRNA按照100 ng/μL∶150 ng/μL的比例稀释。在斑马鱼胚胎处于单细胞时期进行显微注射，每个胚胎注射体积为2 nL。注射后使用胚胎培养液收集于28.5 ℃培养箱培育，第4天随机挑出10个胚胎使用基因裂解液[在984 μL灭菌水中加入Tris Hcl（pH 8.0）100 μL，EDTA 40 μL，Triton 100% 20 μL混匀]裂解，使用P3与P4引物进行PCR扩增，PCR反应条件按照95 ℃ 30 s；35×（95 ℃ 30 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s）；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。2%琼脂糖胶电泳30