DB33_T 822-2011(2014)高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测技术.pdf

ICS 11. 220B41DB33浙江省地電方标准DB33/T822—2011高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测技术RT-PCR detection technique for highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome virus2011-03-25发布201104-25实施浙江省质量技术监督局发布 DB33/T 822—2011BB附录B（资料性附录）检测过程中生物安全和防止交叉污染的措施B. 1样品处理和核酸制备B.1.1样品处理过程中应穿实验服，戴一次性手套、口罩章、相子。一次性手套应经常更换B.1.2提取RNA过程或PCR反应液配制过程应分别在专用的超净工作台内进行：末设专用超净工作台时可选取一个相对洁净的专用区域。B.1.3所有抽提RNA的试验器ⅢL、离心管、PCR管等应进行DEPC水处理。B. 2RT-PCR检测过程B. 2. 1实验前后，应将超净工作台的紫外灯打开照射30min；也可用10%次氯酸钠落液擦拭工作台面，应保持工作台面和环境的清洁干净，B.2.2抽样和制样工具应清洁干净，经无菌处理过，PCR试验的器皿、离心管、PCR管等应DEPC水处理后，121C，15min高压灭菌并烘干后才可使用。B.2.3在进行PCR扩增前，各PCR管盖应盖紧，采用热盖加热（PCR管中不加石蜡油）的PCR扩增仪还应检查PCR管放入加热槽后高度的一致性。B.2.4PCR反应混合液配制、RNA提取、PCR扩增、电泳和结果观察等应分区或分室进行，实验室运作应从洁净区到污染区单方向进行。B.2.5所有的试剂、器材、仪器都应专用，不应交叉互用。 DB33/T 822—2011前言本标准按照GB/T1.1-2009（标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》和GB/T20001.4-2001《标准编写规则第4部分：化学分析方法》的规定编写。本标准由浙江省农业厅提出。本标准由浙江省畜牧兽医标准化技术委员会归口，本标准起草单位：浙江省动物疫病预防控制中心、中国动物卫生与流行病学中心。本标准起草人：徐辉、李晓成、吴发兴、赵灵燕、张燕霞、倪柏锋、周彩琴、陆国林、吴费惑、陈星宇、王燕萍、周蕾。- DB33/T 822—2011高致病性猪蓝耳病RT-PCR检测技术1范围本标准规定了高致病性猪蓝耳病病毒RT-PCR检测技术本标准适用于猪只感染高致病性和美洲型经典猪蓝耳病病毒的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法。3术语和定义下列术语和定义适用于本标准，3. 1高致病性猪蓝耳病 highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome简称HP-PRRS，是由猪繁殖与呼吸综合症（Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS）（俗称蓝耳病）病毒变异株引起的一种猪的急性高致死性疫病。临床上表现为体温明显升高，可达41C以上，眼结膜荧、眼险水肿，咳嗽、气嘴等呼吸道症状：部分猪出现后驱无力、不能站立或共济失调等神经症状。PRRSV是套式病毒目、动脉炎病毒科、动脉炎病毒属成员。3. 2逆转录-聚合酶链反应reversi transcriptase polymerase chain reaction , RTPCR将RNA的反转承（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转永酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。4缩略语下列缩略语适用于本标准。bpbase pair，碱基对.DNAdeoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。SdLNPDeoxyribonucleosideTriphosphates，脱氧核糖核者三磷酸.IFAimmunofluorescenceassay，免疫荧光测定。PCRpolymerase chain reaction，聚合酶链式反应。RTPCRreverse transcription PCR，反转录PCRTaq酶Taq DNA Polymerase, Taq DNA聚合酶。 DB33/T 822—2011DEPCdiethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯.EBEthidiun bromide，澳化乙锭.检测方法除另有规定外，所有实验用试剂均为分析纯，实验用水均为蒸馏水，规格符合GB/T6682的相关规定.5.1试剂5.1.1变性液：见附永A.1。5.1.22mo1/L醋