DB64 711_2011马铃薯脱毒种薯（苗）病毒分子检测技术规程.pdf

ICS 65. 020. 01B16DB64宁夏回族自治区地方标准DB 64/ T7112011马铃薯脱毒种薯（苗）病毒分子检测技术规程2011-1128发布2011-11-28实施宁夏回族自治区质量技术监督局发布 DB64/ T7112011前 言本标准的编写格式符合GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求。本标准由宁夏农林科学院提出。本标准由宁夏回族自治区农牧厅归口，本标准主要起草单位：宁夏农业生物技术重点实验室、宁夏农林科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：宋玉霞、陈晓军、王敬东、陈虞超、张丽、石磊、赵东、李苗、沈瑞清、郭成谨、朱玉斌、马洪爱、甘晓燕。 DB64/ T7112011马铃薯脱毒种薯（苗）病毒分子检测技术规程1范围本标准规定了马铃薯脱毒种薯（苗）病毒分子检测技术规程的术谱和定义、检测对象、抽样规则、检测方法、脱毒植株判定规则和质量标准。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB18133马铃薯脱毒种薯NY/T 4012000脱毒马铃薯种薯(苗)病毒检测技术规程3术语和定义GB18133界定的以及下列术语和定义适用于本标准。3. 1马铃薯脱毒原原种将马铃薯脱毒苗移栽于无马铃薯病源、虫源的隔离区条件下生产的符合质量标准的种薯。3. 2马铃薯脱毒原种由马铃薯脱毒原原种作种薯，在无马铃薯病源、虫源的隔离区条件下生产出的符合质量标准的种薯。3. 3马铃薯脱毒一级种由马铃薯脱毒原种作种薯，在无马铃薯病源、虫源的隔离区条件下生产出的符合质量标准的种薯。3. 4RTPCR反转录聚合酶链式反应，即在逆转录酶作用下，以RNA为模板反转录出与其互补的cDNA链，随后在DNA聚合酶作用下，以cDNA为模板合成出另一条与其互补的DNA链，最后通过PCR进行DNA扩增的过程。1 DB64/ 5内标引物在RT-PCR反应中，以马铃薯肌动蛋白基因为内对照而设计的扩增引物。3. 6特异性条带在RT-PCR反应中，以各病毒特有序列设计引物扩增得到的片段大小特定的条带。3. 7感病植株允许率马铃薯脱毒种薯（苗）中感染病毒植株数的允许比率。检测对象满毒检测应符合表1的规定。表1检测病毒的特性病毒名称病毒类型症状危害马铃薯纺循形无蛋白外壳感病植株表现矮化，束项，叶失绿，叶骨面紫红危害分布十分广泛，造成块茎变细块基类病毒的裸露RNA类色，叶片变小，叶析与主茎的角度变小，思病块长，形如纺，严重影响马铃著的(PSTVd)病毒基的皮色也会发生稳色现象。马铃薯X病毒产量和品质，造成减产20%~60%。单链RNA 病毒最常见的整状是轻型斑驳花叶，表现为叶片顽色(PVX)深浅不一，但叶片平晨不变小，不变形，不坏死，造成10%的减产，马铃著Y病毒单链RNA病毒初期症状表现为植标花叶、叶片坏死：触发症状(PVY)为植株矮化、皱缩、理驳和卷曲等。造成30%~50%的减产。马铃薯S病毒RNA 病毒感病核株表现为叶脉下凹，叶片粗缩，微向下弯(PVS)病株常产生小块圣，造成减产曲，叶色变浅，轻度垂叶，核栋呈开散状。10%~20%,病株由下部至上部沿叶片中肽卷曲，呈此状，叶马薯卷叶病正链RNA病毒肉变脆呈革质化，叶背有时出现紫红色，上部叶毒 (PLRV)易感品种造成90%减产，一般品种片裙绿，重者全株叶片卷典，整个植株直立矮化，造成40%~70%减产，块茎变瘦小，薯肉呈现锈色网纹斑。5抽样规则原原种在瓶苗期进行第1次检测，在生育期进行第2、3次检测，第2次检测在植株现蓄期，第3次检测在植株盛花期。原种和一级种薯在生育期进行2次检测，第1次检测在植株现蕾期，第2次检测在植株盛花期。检测过程中的抽样规则按NY/T401-2000的规定执行。2 DB64/ 测方法采用分子生物学RT-PCR（反转录聚合酶链式反应）扩增法对各类病毒进行检测。6.1总RNA提取取各样品植株叶片，液氮研磨后提取总RNA。内标扩增为了确定所提取RNA（核糖核酸）的质量，设计马铃薯肌动蛋白基因为内对照，利用内标引物（上游引物5-GCAGGAATCCACGAGACTACATACAA-3和下游引物5-GCCAAGATAGAGCCTCCAATCCAGAC-3）进行PCR扩增，若扩增得到大小为227bp的目的条带，则判定反转录cDNA质量良好，作为后续检测所用模板。6.3马铃薯纺锤形块茎类病毒（PSTVd）检测利用内标引物与特异性引物（上游引物5-GGATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAGCCG-3*和下游引物5-COOGGAAACCT GGAGC GAACTGG-3*）进行内标条带（22