NY_T 3833-2021CN微生物肥料菌种保藏技术规范.pdf

ICS 65.080CCS B 10NY中华人民共和国农业行业标准NY/T3833—2021微生物肥料菌种保藏技术规范Technical specification of culture preservation for microbial fertilizers2021-05-07发布2021-11-01实施中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3833—2021附录C(规范性)沙土管保藏法C.1沙土管制备C.1.1沙土准备将河沙用60日过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80日过筛，去掉细沙，用吸铁石吸去铁质，放人客器中用10%的HCI没泡，如河沙中有机物较多可用20%的HCI没泡。24h后倒去盐酸.用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或赠干。另取地面下40cm~60cm非耕作层贫售且黏性较小的土壤研碎，100目过筛，水洗至中性，烘干。C.1.2沙土管灭菌将处理后的沙、土按质量比2：1混合。混匀的沙土分装人安部管或小试管中，高度为1cm左右，塞好棉塞，包扎防潮纸，121℃高压蒸汽灭菌30min.室温放置1d~2d后，再次121℃高压蒸汽灭菌30 min,C. 1. 3无茵检查随机选取几支灭菌后的沙土管，在无菌操作条件下取少许沙土至空白麦芽汁培养基和牛肉膏蛋白肠液体培养基中，于37C增养1d3d，检查无菌生长后方可使用C.2斜面培养物的准备按照附录A中A.1、A.2.1和A.3的规定执行。C.3菌种制备向培养好的斜面培养物中注人3mL~5mL无菌水，洗下葡答或范子制成菌悬液液体培养物可离心后弃去部分上清液，留取下部菌体及少量上清波制成菌悬液，用无图吸管或滴管吸取图起微均匀滴人沙土管中，每管0.2mL~0.5mL。）放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。C.4干燥混菌后，将沙土管放干燥器申自然干燥或用真空泵将干媒器抽真空加连样品十燥C. 5保藏干爆燥后的沙土管用火焰熔封管口或石蜡密封管口后，置于4℃6℃低温或室温干燥环境保藏，每隔半年检查一次菌种存活性及纯度。C. 6恢复培养在无菌操作条件下，打开沙土管，取部分沙土置于适宜的培养基上，长出菌菩后再转接一次。或取沙土粒置于适宜的液体培养基中，增殖培养后再转接斜面培养基。 NY/T 3833—2021附录D【规范性)冷冻干燥保藏法D.1冷冻干燥管的选择与清洗冷冻干爆管一般采用耐温度掌变、耐压、管壁厚度均一、且为中性玻璃的安题管。管内径为8mm左石，长度为100mm110mm。清洗安靓管时，先用2%的HC1没泡过夜，再用自来水冲洗3通以上，接者用蒸增水冲洗、没泡至pH中性，然后干燥、加棉案.包扎防满纸，121℃高压蒸汽灭菌30min-~60min，灿干，备用。D. 22保护剂的选择和准备保护剂可以减少冷冻干燥引起的微生物细胞损伤。冷冻干燥保藏法常用的保护剂为脱脂乳。脱脂乳的准备：将脱脂奶粉溶于蒸增水，配制浓度为12%（W/V)的脱脂乳；也可用新鲜乳液煮沸，冷却后4000r/min高心30min.弃上层乳油，中间部分为脱脂乳，脱脂孔经113℃高压蒸汽灭菌15min~20min，灭菌后于37℃培养24h.检查是否灭菌制底.检验无菌后置于4℃～6.℃冰箱中备用。D.3菌景液的制备D.3.1用斜面培养物制备菌悬液在无菌操作条件下，先将少量灭菌保护剂加人斜面培养物上，轻轻刮下菌或孢子，制成菌悬液。注意不宜泡深过多或刺挖琼脂。菌悬液细胞浓度为10°个/mL～10°个/mL或孢子浓度为10°个/mL以上为宜.D.3.2用液体培养物制备菌悬液高心收集液体培养的菌体，弃上清液，加人保护剂，将菌体与保护剂混匀，制成菌悬液D.4分装应在无国操作条件下分装围被。采用较长的满管，直接将菌愁报滴人要管底部，注意不要额污上部管壁，每管分装量0.1ml.~0.2ml.。若是球形安额管，装量为半个球部，分装时间尽量要短，D.5预冻将装有菌悬液的安管置于一80℃低温冰箱预冻2h以上，使温度下降到40℃~-35℃。D.6冷冻干燥将预冻后的安暂管迅速置于已充分预冷的冷冻干媒机样品舱内，关闭放气解，打开真空泵开始冷冻干燥，接近干燥完成时.适当升温（按冷冻干燥机的具体要求进行操作），确认冷冻干燥完毕后，缓慢打开放气阀，取出样品安额管置于干燥器内，冷冻干爆时间一般为8h20h。判断冷冻干媒已完全的指标：a)安额管内冻干物呈酥松块状或松散片状：真空度接近空载时的最高值；c)冷冻干燥机显示的样品温度与舱内温度接近；d)蒸馏水对照管中的水分已完全挥发或1%一2%氧化钻的对照管已呈深蓝色。8 NY/T 3833—2021D. 7安额管封口及保藏从干燥器中取出冷冻干舜完全的安颜管，在距管口5cm左f:川喷射火焰(喷灯、焊枪等)将安额管拉纠-然后将安鼠管日连按到与实象相连的格皮管1-打并其象，在真空条件下（一股真空度达到0，01mmHg-即