SN_T 4418-2016出口食品中骆驼源性成分的检测 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4418—2016出口食品中骆驼源性成分的检测实时荧光PCR法Detection of Camelus ingredient in export food-Real-time PCR method2016-03-09发布2016-10-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局O SN/T4418—2016前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：吴亚君、陈颖、杨艳歌、王斌、王、刘鸣畅、韩建勋、黄文胜、邓婷婷。 SN/T4418—2016出口食品中骆驼源性成分的检测实时荧光PCR法1 范围本标准规定了食品中骆驼源性成分的实时荧光PCR检测方法，可以对食品中骆驼源性成分进行定性检测，在检测范围和技术指标方面可满足食品本标准适用于乳品，新鲜、冷冻和加工的肉品中骆驼源性成分的定性检测。本标准所规定方法的最低检出限（LOD）为0.01%（质量分数2规范性引用文件日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403—2008实验室质#量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义、缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1.1骆驼camelus偶蹄目骆驼科骆驼属，包括单峰骆驼和3.1.2实时荧光PCRrealtimePCR监控整个PCR扩增过程，实现对起始在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实日模板的定量及定性分析。3.1.3Ct 值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonuleicacid)dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleosidetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide)Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris(Hydroxymethyl)aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid) SN/T4418—2016Taq：水生栖热菌（Thermnsaquaticus）OD：光度密度（opticaldensity）Cytb：线粒体细胞色素b基因（cytochromeb）GH：生长激素基因（growthhormonegene）4方法提要提取DNA，采用骆驼的特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR信号，对食品中骆驼成分进行定性检测。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。5.1检测用引物和探针：骆驼源性成分扩增引物和探针、内参照引物和探针详见表1。骆驼引物扩增的靶标序列参见附录A。表1骆驼Cytb基因序列引物探针物种名称引物/探针序列（5→+3）扩增片段长度靶基因F:CCTCAGCAGGGTCTTCACCA哺乳动物RTTCAGCTTCTCGTAGACNCG66 bpGH（内参照）P:FAM-CAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGA-TAMARF:ATTCTTYGCCTTCCAYTTCA骆驼R:AGCGTATGCGAAYAGGAART307bpCytbP:(FAM)-CCTACACGAAACAGGYTCTAATAACCCGAC-(TAMRA)5.2三氯甲烷（氯仿）。5.3异丙醇。5.4 CTAB 提取液: 20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L Naz EDTA,pH CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl,pH8.0。5.6酚-三氯甲烷-异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行配制。5.7三氯甲烷-异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制。5.870%乙醇（体积分数）。5.9 NaCl溶液(1.2 mol/L)。5.10蛋白酶K（20mg/mL）。5.11实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1 U~2U(Unit，酶学单位）的Taq酶、1XPCR buffer、2.5 mmol/L 的 Mg²+、0.2 U UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A,C,G)TPs、