SN_T 3675-2013草莓花枯病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3675—2013草莓花枯病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Rhizoctonia fragariae Husain et W.E.McKeen2013-08-30发布2014-03-01实施中华人民共和国1发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T3675—2013前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖北出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王振华、冯汉利、张剑锋、李凤新、王宏毅、叶芸、吴品珊、吴翠萍、李彬、王英超、罗加凤。 SN/T3675—2013草莓花枯病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了草莓花枯病菌检疫鉴定方法。本标准适用于草莓种子、种苗及果实上的草莓花枯病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3病菌基本信息中文名：草莓花枯病菌学名：Rhizoctonia fragariaeHusainetW.E.Mckeen分类地位：草莓花枯病菌无性态Rhizoctoniafragariae属于真菌界Fungi，半知菌门Basidiomycota，丝孢纲Hyphomycetes，无孢目Agonomycetales，无孢科Agonomycetaceae，丝核菌属Rhizoctonia。有性态Ceratobasidium cornigerum，属于担子亚门Basidiomycota，伞菌纲Agaricomycetes，鸡油菌目Cantharellales，角担子菌科Ceratobasidiaceae，角担菌属Ceratobasidium。传播途径：带菌的草莓、根系、花蕾、土壤是远距离传播主要途径。其他信息参见附录A。4方法原理根据草莓花枯病菌在寄主上的为害症状、形态特征、培养性状等特征进行结果判定。5仪器设备和主要试剂5.1仪器设备PCR仪、超净工作台、高压灭菌器、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、恒温水浴锅、微量进样器、电泳仪、凝胶电泳设备、凝胶成像系统、体视显微镜、生物显微镜（带显微照相装置）、天平（感量0.1g）、测微尺、光照培养箱等。5.2主要试剂和培养基琼脂糖粉、次氯酸钠（NaCIO）、氯霉素、引物、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）、乙二胺四乙酸（EDTA）、无水乙醇、蛋白酶K、苯酚、三氯甲烷、异戊醇、乙酸铵（NHAc）、氯化镁（MgCl2）、PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶、溴化乙锭（EB）、液氮、3.5%甲醛、二氨基-2-苯基吲哚（DAPI)、硝酸钾（KNO:）、水琼脂和马铃薯葡萄糖培养基（PDA）。实1 SN/T3675—2013验用水应符合GB/T6682中的规定。6现场检疫检查根是否根腐，颜色棕色或黑色，植株是否矮小、萎，似冻害状。花开时，花粉囊是否黑色，花梗正常，花心黑色。果实的组织是否变褐，变硬，成熟果实是否变软，表面是否有白色稀疏菌丝体（参见附录B)。7实验室检疫7.1直接镜检将有明显病症的根系、花蕾或果实材料置于体视显微镜下检查，或直接挑取病部子实体制成玻片，置于生物显微镜下镜检，观察记录菌丝、担子果、担子的形态特征和着生方式，并测量其大小。7.2保湿培养如根系、花蕾或病果上只有可疑病状而无明显病症，则将病根（截成5cm）或繁殖材料置于样品袋中，于20℃～25℃下保湿培养，每天观察症状的变化，并进行显微镜检或分离培养。7.3病原菌的分离培养取具有疑似发病症状的根或繁殖材料，用自来水冲洗并用吸水纸吸干表面水分。用1%NaCIO表面消毒1min～2min，用无菌水冲洗-3-次，用无菌吸水纸吸干表面水分后，放人水琼脂（含250μg/mL氯霉素）表面，当组织表面长出菌丝后，将菌丝转移至PDA平板（含250μg/mL氯霉素）上，继续培养2d～3d。小心挑取新长出的菌丝，转接到新的PpA平板上进行真菌的纯化培养。连续转接3次，获得真菌的纯培养物。7.4菌丝和菌核的形态观察将纯培养物接种在含有1nm厚PDA的来板上，培养3d5d，在菌丝生长最旺盛的边缘取出带有菌丝的琼脂碟片，在3.5%的甲醛中固定,用无菌水冲洗，然后在二氨基-2-苯基吲哚（DAP