SN_T 3994-2014动物产品中肠出血性大肠杆菌O104:H4检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3994--2014动物产品中肠出血性大肠杆菌O104：H4 检疫技术规范Quarantine protocol for Enterohemorrhagic Escherichia coliO104 : H4 in animal product2014-11-19 发布2015-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局AGO SN/T 3994--2014前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本标准主要起草人：杨俊兴、陶虹、唐金明、花群义、阮周曦、吕建强、林庆燕、王玉玲、曹琛福、谢晓露、刘建利、廖立珊。I SN/T 3994--2014动物产品中肠出血性大肠杆菌0104：H4检疫技术规范1范围本标准规定了动物产品中肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC)O104：H4的检疫技术规范。本标准适用于动物产品中的EHECO104：H4的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对BPW:缓冲蛋白陈水CT-SMAC:改良山梨醇麦康凯培养基DNA:脱氧核糖核酸dNTP:脱氧核糖核苷三磷酸E.coli:大肠杆菌EHEC:肠出血性大肠杆菌ELISA：酶联免疫吸附试验mTSB:改良胰蛋白陈大豆肉汤PBS:磷酸缓冲液PCR:聚合酶链式反应SMAC:山梨醇麦康凯培养基4设备与材料4.1主要仪器设备4.1.1恒温培养箱。4.1.2均质器:2 000 r/min～12 000 r/min。，高压灭菌锅。4.1.3’4.1.4电子天平：精确值0.0001g。 SN/T 3994—20144.1.5冷冻离心机。4.1.6全自动微生物及药敏分析系统。4.1.7生物显微镜。4.1.8普通 PCR仪。4.1.9荧光 PCR仪。4.1.10电泳分析仪。4.1.11水平电泳槽。4.1.12pH计。4.1.13ELISA洗板机:96孔(8X12)。4.1.14酶标仪：适用于96孔（8×12)ELISA板检测，可满足波长450nm使用。4.22培养基与试剂除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，用于PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有实验用水均为灭菌双蒸水，应符合GB/T 6682中一级水要求。4.2.1缓冲蛋白陈水(BPW)：配方见附录 A。4.2.2改良胰蛋白陈大豆肉汤(mTSB):配方见附录 A。4.2.3新生霉素（Novobiocin）。4.2.4丝裂霉素 C(Mitomycin C)。4.2.5改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂:配方见附录 A。4.2.6改良科玛嘉显色琼脂。4.2.7革兰氏染色液：配方见附录A。4.2.8荧光 PCR试剂盒。4.2.91PCR试剂盒。4.2.10大肠杆菌诊断血清（包括O104诊断血清及H4诊断血清）。5操作步骤5.1检测流程见图1。2 SN/T 3994—201425 g +225 mL BPW, 均质检样25 g36 ℃±1℃;18 h~24 hDNA 制备实时荧光PCR检测stx2基因阴性阳性25 mL+ 225 mL含新生素mTSB36 ℃±1℃; 6 h～8 h1mL＋4mL含丝裂霉素的mTSB36 ℃±1℃;16 h～~18 h或ELISA检测志贺样毒素阴性阳性CT~SMAC平板和改良科玛嘉显色琼脂平板36 ℃±1 ℃: 18 h ~～24 h挑4～6个可疑菌落生化试验PCR检测wzy、flic基因0104、H4血清型鉴定报告未检出报告图 1 检测流程图5.2试样制备从混合样品中取出代表性样品，如含有脂肪则需先去除脂肪，用均质器将样品充分均质。用四分法分出不少于500g作为试样，装人灭菌容器内，加封后作好标记。样品采集后应尽快检测，若不能及时检测,可在 2℃～4 ℃保存 18 h。3 SN/T 3994-20145.3前增菌称取5.2中制备的样品25g放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min,或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃士1℃培养18h～24h。5.4实时荧光 PCR 检测 stx 2 基因5.4.1stx