SNT 2080-2008栎树猝死病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2080—2008栎树猝死病菌检疫鉴定方法Identification of Phytophthora ramorum Werres,De Cock Man int Veld2008-04-29 发布2008-11-01实施FOB中华人民共和国余层较 18515 发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2080—2008前言本标准附录 A、附录 B、附录 C 和附录 D为资料性附录本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院。本标准起草人：吴品珊、严进、廖太林、巫燕。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 2080-2008栎树猝死病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了植物检疫中栎树猝死病菌的检疫鉴定方法，本标准适用于针对栎树猝死病菌寄主的苗木、原木、树皮、枝条、枝叶等植物部分及其土壤和介质，以及木材、木包装和木制品的人境检疫。2原理2.1分类地位英文名: pathogen of sudden oak death,pathogen of ramorum leaf blight学名 : Phytophthora ramorum Werres, De Cock Man int Veld栎树猝死病菌（Phytophthora ramorum），也称多枝疫霉，属真菌界（Fungi)，卵菌门（Oomycota）卵菌纲(Oomycetes），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉属（Phytophthora de Bary）。Phytophthora ramorum 可侵染多种林木和花卉植物，造成栎树等树木猝死(Sudden Oak Death，简称 SOD），以及杜鹃、荚等花卉枝叶枯萎（Twig Blight of Rhododendron）。病菌在世界上的分布和寄主植物参见附录 A和附录B。2.2 鉴定原理根据栎树猝死病菌在寄主上的为害症状、形态学特性、巢式PCR特异性扩增片段作为鉴定依据。3仪器和用具3.1仪器3.1.1生物显微镜，体视显微镜。3.1.2光照生物培养箱。3.1.3高压灭菌器。3.1.4高速离心机。3.1.5PCR扩增仪，电泳仪，凝胶成像仪。3.2用具塑料盒。.2黑光灯(18 W,320 nm～380 nm)。3.2.3塑料研，移液器。4试剂和培养基4.1 试剂4.1.1琼脂粉,V8液,胡萝卜,杜鹃叶片。4.1.250%匹马霉素，氨苄青霉素钠盐,利福平钠盐，五氯硝基苯,碳酸钙。4.1.3SDS,Tris-HC1,氯化镁，盐酸,EDTA，氢氧化钠，乙酸钠，氯化钾，Tris,CTAB,TBE,无水乙醇，苯酚,溴化乙锭(EB),三氯甲烷,异丙醇,异戊醇。4.1.4蛋白酶 K,Taq聚合酶,dNTP,DNA分子量 Marker(100 bp)。4.1.5 巢式 PCR 引物 Phyto1/Phyto4、Phyto2/Phyto3。 SN/T ·2080—20084.2培养基4.2.1选择性培养基 PARP-V850mL过滤后的V8液,17g琼脂,950mL蒸馏水，灭菌后冷却到50℃，加人在50%的匹马霉素0.01 g、氨苄青霉素钠盐 0.25 g、利福平钠盐 0.01 g和五氯硝基苯 0.05 g(可按比例在二甲基亚中溶解后加人）。4.2.2胡萝卜丝培养基 CPA50g胡萝卜切丝，22 g琼脂,1000 mL蒸馏水,灭菌。4.2.3V8 培养基V8液体100mL，加人2.5g碳酸钙，,15g琼脂，蒸馏水900mL，灭菌。5鉴定方法5. 1 症状检查检验苗木时，主要查验枝梢和叶部。杜鹃花等花卉植物症状为叶片上有黑褐色病斑，茎部有凹陷溃疡斑，枝梢和叶常出现枯萎。检验栎树等原木木材时，重点查验溃疡斑。溃疡凹陷或平坦，常有暗红至黑色的粘性流胶渗出，树皮内部组织褪色，坏死区域的边缘有黑环围绕。取有疑似症状的植物的叶、枝、树皮、根等植物部分做分离培养。土壤和栽培介质也是传播病菌的主要途径，检验时收集被携带进境的土壤和栽培介质，做诱集试验。5.2分离培养和诱集5.2.1植物组织和木材的分离培养取植物组织或木材上的病健交界处(无明显症状的取靠近地下部的组织)5mm～10mm，0.5%次氯酸钠消毒2 min～5min,在选择性培养基 PARP-V8,和胡萝卜丝培养基 CPA上，20℃～22℃黑暗培养1周～2周。如有白色真菌菌落出现；可转人y8培养基上20℃12h光照/12h黑暗培养。5.2.2土壤和栽培介质的诱集塑料盒中放入土壤或介质，加人2倍体积的无菌双蒸水，将数张健康的杜鹃叶片（国内市场上杜鹃品种即可）流水冲洗干净，滤纸吸干水分，叶面潮上漂放在水上，盖上盒盖，15℃12h光照/12h黑暗培养。3d后开始