NY 911-2004饲料添加剂 β-葡聚糖酶活力的测定 分光光度法.pdf

ICS 65.120B 46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 911—2004饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定分光光度法Determination of β-glucanase activity in feed additives-Spetrothoetric method2005-01-04发布2005-02-01实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 911-—2004前言本标准的附录为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：中国农业大学农业部饲料工业中心、芬兰饲料国际有限公司、广东溢多利生物技术股份有限公司、辽宁众博饲料科技有限公司、北京中农博特生物工程技术有限公司、武汉新华扬生物有限公司。本标准主要起草人陆文清、李德发、张丽英、朴香淑、邢建军、刘兴海。I NY/T 911—2004饲料添加剂β-葡聚糖酶活力的测定分光光度法1范围本标准规定了用还原糖比色法测定饲料添加剂中β-葡聚糖酶的活力。本标准适用于饲料添加剂用的饲料酶产品，也适用于添加有 β-葡聚糖酶的浓缩饲料和添加剂预混合饲料。样品的最低检出量为1.0U/g。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本标准。β-葡聚糖酶活力单位在37℃、pH为5.5的条件下,每分钟从浓度为 4 mg/mL的β-葡聚糖溶液中降解释放1 umol 还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位(U)。4原理β-葡聚糖酶能将 β-葡聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中纤维素酶的活力成正比。因此,通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中纤维素酶的活力。警告：在处理酸、碱和配制DNS试剂时，请戴上保护眼镜和乳胶手套，实验应在通风橱或通风良好的房间进行。一旦皮肤或眼睛接触了上述物质，应及时用大量的水冲洗。5 试剂与溶液除特殊说明外,所用的试剂均为分析纯,水均为符合 GB/T 6682中规定的二级水。5.1 氢氧化钠溶液,浓度 c(NaOH)为 200 g/L称取氢氧化钠20.0g，加水溶解，定容至100mL。5.2 乙酸溶液,浓度 c(CH;COOH)为 0.1 mol/L吸取冰乙酸0.60mL,加水溶解,定容至100mL。5.3 乙酸钠溶液,浓度 c(CHsCOONa)为 0.1 mol/L称取三水乙酸钠1.36g,加水溶解,定容至100mL。5.4 乙酸一乙酸钠缓冲溶液,浓度 c(CHsCOOH一CH;COONa)为 0.1 mol/L,pH 为 5.51 NY/T 911—2004称取三水乙酸钠23.14g,加人冰乙酸1.70 mL。再加水溶解,定容至2000mL。测定溶液的pH。如果pH偏离5.5,再用乙酸溶液(5.2)或乙酸钠溶液(5.3)调节至5.5。5.5葡萄糖溶液,浓度 c(CgH120g)为 10.0 mg/mL称取无水葡萄糖1.000g,加乙酸一乙酸钠缓冲溶液(5.4)溶解,定容至100mL。5.6β-葡聚糖溶液,浓度为 8.0g/L称取 β-葡聚糖 0.40 g,加人乙醇 5.0 mL润湿 β-葡聚糖,再加人 40 mL 乙酸一乙酸钠缓冲溶液（5.4)。磁力搅拌,同时缓慢加热,直至β-葡聚糖完全溶解。（注：在搅拌加热的过程中,可以补加适量的缓冲液,但是溶液的总体积不能超过50mL。)然后，停止加热，继续搅拌30min，用乙酸一乙酸钠缓冲溶液(5.4)定容至 50mL。β-葡聚糖溶液能立即使用,使用前适当摇匀。4℃避光保存,有效期为3d。冷冻保存,有效期为2个月（使用前,在4℃条件下解冻)。5.7 DNS 试剂称取3,5-二硝基水杨酸3.15g（化学纯）,加水 500mL，搅拌5s,水浴至45℃。然后,逐步加人100mL氢氧化钠溶液(5.1),同时不断搅拌，直到溶液清澈透明（注意：在加人氢氧化钠过程中，溶液温度不要超过48℃）。再逐步加人四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g。继续45℃水浴加热，同时补加水300mL，不断搅拌,直到加人的物质完全溶解。停止加热，冷却至室温后，用水定容至1000mL。用烧结玻璃过滤器过滤。取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存。室温下存放7d后可以使用,有效期为6个月。6仪器与设备6.1实验室用样品粉碎机或碾钵6