SN_T 2678-2010进出口淡水产品中微囊藻毒素的检测方法 酶联免疫吸附法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2678—2010进出口淡水产品中微囊藻毒素的检测方法酶联免疫吸附法Determination of microcystin in fresh water products for import and export--Enzyme-linked immunosorbent assay2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2678-2010言前本标准按照GB/T 1.1—2009 给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国青岛出人境检验检疫局、中国科学院水生生物研究所、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：吴振兴、李伟才、吕青、甘南琴、宋立荣、陈伟、曹际娟、王秋艳。 SN/T 2678—2010进出口淡水产品中微囊藻毒素的检测方法酶联免疫吸附法范围1 本标准规定了进出口鱼、虾、贝等淡水产品中微囊藻毒素的酶联免疫吸附检测方法。本标准适用于进出口鱼、虾,贝等淡水产品史微囊藻毒素的检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法。3方法提要本标准以甲醇水溶液来提取淡水产品中的微囊藻毒素经过固相萃取柱净化处理后，样品中的微囊藻毒素与微囊藻毒素酶标记物共同竞争结合预先包被于微孔板上的抗体，以清洗液重复洗涤各微孔，然后加人底物显色，以酶标仪测定吸光度值，根据吸光度值得出试样中微囊藻毒素的含量。4试剂和材料级水除注明外，所用试剂均为分析纯|水为GB/T6682规定的4.1微囊藻毒素检测试剂盒(参见附录 A)4.2甲醇。4.3氢氧化钠(NaOH)。4.4磷酸氢二钠(Na2HPO：·12H4.5#提取液：70%甲醇水溶液。4.6淋洗液：20%甲醇水溶液。氢氧化钠溶液：称取氢氧化钠（4.3)0.4 g,用水溶解并定容至100mL。4.7磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO：·12H²O)（4.4)34 g，用水溶解并定容至1L，以氢氧4.8.化钠溶液(4.7)调节pH至8.0。4.9微囊藻毒素标准品：纯度大于等于95%。4.10微囊藻毒素标准品储备液：以甲醇作为溶剂配制成100μg/L的储备液，于一20℃条件下保存。4.11固相萃取柱：SEP-PAK CLASSIC Ci8（或相当产品）。5仪器和设备5. 1天平：感量 0.01 g。 SN/T 2678—20105.2均质器。5.3混合振荡器。5.47离心机：转速5 000 r/min。5.5单通道移液器:5 μL～50 μL,10 μuL～100 μL,100 μL～l 000 μL,1 mL～5 mL。5.6 多通道移液器:50 μL～300 μL。5.7酉酶标仪。5.8旋转蒸发仪。5.9氮吹仪。5.10超声波清洗机。6试样的制备与保存6.1试样的制备从抽取的原始样品中取可食用部分，用清水冲去污物和泥沙，用滤纸或者干净纱布小心的吸去多余的水分，放入搅碎机中搅碎至匀浆状，均分成两份，装入清洁的容器内，作为试样。密封，并标明标记。6.2试样的保存将试样于18℃±2℃以下避光保存,7d内分析完毕。7 分析步骤7.1　提取准确称取2 g试样置于离心管中,加人 5 mL提取液（4.5），旋涡均匀混合 2 min,超声提取 10 min（频率：50kHz,功率：100W），4000r/min低温离心15min，取上清液;在残渣中再次加人5mL提取液（4.5）,进行重复提取，处理条件同上，合并两次提取的上清液。旋转蒸发去除甲醇,加水定容至10 mL，待过固相萃取柱净化。7.2　净化先后以5mL甲醇（4.2)和5mL水活化固相萃取柱（4.11）,将上述提取液缓慢通过固相萃取柱，以5mL淋洗液(4.6)淋洗固相萃取柱,再以2 mL甲醇(4.2)将毒素洗脱,加人8mL水稀释,取50μL进行分析。7.3测定条件7.3.1操作条件所有操作应在室温下(20℃～24℃)进行,微囊藻毒素检测试剂盒（4.1)中所有试剂的温度均应回升至室温(20℃～24℃)后方可使用。7.3.2洗板条件人工洗涤次数5次以上，每次加人洗涤液量为250μL；自动洗板可以预定5次。7.3.3酶标仪测定条件酶标仪测定波长为 450 nm。2 SN/T 2678—20107.4测定步骤7.4.1将足够数量的微孔板放置于微孔架上，记录标准品及样品等在微孔架上的位置。7.4.2吸取50uL微囊藻毒素酶标记物至各微孔中。7.4.3吸取50 uL标准品溶液及样品提取