NY 914-2004饲料中氢化可的松的测定 高效液相色谱法.pdf

ICS 65.120B 46NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 914—2004饲料中氢化可的松的测定高效液相色谱法Determination of Hydrocortisone in Feeds-High-performance Liquid Dhromatography2005-01-04 发布2005-02-01 实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 914--2004前言本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：农业部饲料质量监督检验测试中心（成都）、成都华西希望集团。本标准起草人：李云、林顺全、余林、冯娅。I NY/T 914—2004饲料中氢化可的松的测定高效液相色谱法1范围本标准规定了用高效液相色谱法(HPLC)检测饲料中氢化可的松含量的方法。本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中氢化可的松地测定。本方法最低检测限为 0.05 mg/kg。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1　饲料采样方法3方法原理一紫外检测法分离测用甲醇提取试样中的氢化可的松，以乙腈、水作为流动相,用高效液相色谱一定。4试剂和溶液除特殊注明外,本法所用试剂均为分析纯,水符合GB/T 6682一级水的规定。4.1 乙腈色谱纯。4.2甲醇色谱纯。4.3氢化可的松标准液4.3.1氢化可的松标准贮备液准确称取氢化可的松标准品（纯度≥98%)0.1000g,置于100mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容,其浓度为1000μg/mL的储备液，置于4℃冰箱中保存。4.3.2氢化可的松标准工作液分别准确吸取-定量的标准贮备液（4.3.1），稀释10倍，用甲醇稀释、定容，配制成浓度为2.5μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL、12.5 μg/mL、17.5 μg/mL 的标准工作液。5仪器和设备5.1实验室常用仪器、设备。5.2高效液相色谱仪配紫外检测器。5.3电子天平感量 0.000 1 g。5.4离心机1 NY/T 914—20043 000 r/mino5.5振荡器5.6玻璃具塞三角瓶250 mL.5.7微量进样器5.8微孔滤膜0.45 μmo6试样制备按GB/T14699.1抽样,取有代表性的样品，四分法缩减取约200g,经粉碎，全部过40目孔筛，混匀装人磨口瓶中备用。7 测定步骤7.1提取按不同的饲料产品,准确称取配合饲料、浓缩饲料2g～10g,预混料0.5g～4g(准确至 0.0002g)样品,置于250mL玻璃具塞三角瓶中,加入40 mL甲醇,往复震荡30 min,静止10 min,过滤,再向饲料中分别加人30mL甲醇,重复提取2次。合并3次提取液,用甲醇定容至100mL。取10mL置离心管中，3000r/min离心5min，取上清液用0.45μm微孔有机滤膜过滤作为试样制备液，供高效液相色谱分析。7.2测定7.2.1 HPLC 色谱条件色谱柱:Ci8柱,长240 mm、内径4.6mmi.d.）,粒径5.0μum或相当者。柱温:室温。流动相：乙腈+水=25+75(V+ V)。流速:1.0 mL/mino波长:254 nmo进样体积：20μL。7.2.2 HPLC 定量测定按仪器说明书操作,取适量试样制备液和相应浓度的标准工作液，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。8 确证8.1对检出氢化可的松的样品,应用重叠色谱分析来确证。8.2重叠色谱法以试样提取液中加入适量的氢化可的松标准工作液（4.3.2),加人的量应与提取液中的氢化可的松的量相当。依次注人样品的提取液、氢化可的松标准工作液（4.3.2)和添加了氢化可的松标准工作液（4.3.2)的样品提取液。如果添加氢化可的松标准工作液(4.3.2)的样品提取液样品所产生峰的半峰宽变化不大于10%，且峰高或峰面积发生了成比例的变化，则可确证原氢化可的松峰就是氢化可的松的。9 结果计算与表述9.1计算公式2 NY/T 914--2004试样中氢化可的松的含量按式(1)计算：m1(1)X :mXn式中:X一一试样中氢化可的松的含量,单位为毫克每千克(mg/kg);-HPLC试样色谱峰对应的氢化可的松的质量，单位为微克（ug);m一试样质量，单位为克(g);m-n —稀释倍数。9.2测定结果用平行测定的算术平均值表示保留至小数点后1位。10重复性两个平行测定的相对偏差不大于10%。3 t00z--ti6 L