SN_T 2759-2011栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2759-2011栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法Quarantine and identification ofPhytophthora cambivora (Petri) Buisman2011-02-25 发布2011-07-01实施6796501533中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2759—2011前言本标准按照GB/T 1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：封立平、刘会梅、王英超、厉艳、吴兴海、纪瑛、吴品珊。1 SN/T 2759—2011栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法范围1本标准规定了植物检疫中栗黑水疫霉病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于栗黑水疫霉病菌寄主苗木、插枝等植物材料及其土壤和介质中的栗黑水疫霉病菌的定(参见附录 A)。2 原理2.1分类地位栗黑水疫霉病菌[Phytophthora cambivora(Petri)Buisman(1927),异名 BLepharospora cambiv-ora Petri，（1917)等］属卵菌门（Oomycota)卵菌纲(Oomycetes），腐霉目（PythiaLes），腐霉科（Pythia-ceae）,疫霉属（Phytophthora）。主要疱害寄主的根、茎,引发树木的多种病害，如栗树的黑水病（inkdisease)，桃树的根腐病（root rot），挪威械的茎溃疡病(stem canker)等。2.2鉴定依据以栗黑水疫霉病菌的寄主范围、在寄主植物上的症状-形态学特征、生物学特征为鉴定依据。3仪器设备及试验用具3.1生物显微镜（具油镜镜头）。3.2具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数木低于50倍)。3.3目镜和镜台测微尺。3.4高压灭菌锅。3.5电子天平。3.66超净工作台。3.7光照恒温培养箱。3.8酒精灯。3.9医用手术剪、镊子。3. 10烧杯(1000 mL)。3.11试管(直径:12 mm)。3. 12培养Ⅲ(直径:9 cm）)。3. 13载玻片、盖玻片。3.14三角瓶(250 mL)。3. 15量筒(500 mL)。3. 16ParafiLm膜或无色透明塑料袋。 SN/T 2759--20114试剂与培养基4.1 试剂4.1.1匹马菌素（pimaricin），氨苄青素（ampiciLLin），利福平（rifampicin），制霉菌素（pimaricin），五氯硝基苯（pentachLoronitrobenzene），制霉菌素（pimaricin）。4.1.2琼脂粉，玉米粉，大米粉。4.1.370%酒精。4.1.4棉蓝试剂。4.1.5无荧光显微镜物镜镜头油（Na=1.516）。4.1.6永久封片剂。4.2 培养基4.2.1基础培养基用于栗黑水疫霉病菌的保存和培养性状的观察、测定。采用胡萝卜琼脂培养基（CA）、大米琼脂培养基（RA）、玉米粉琼脂培养基（CMA）。配方参见附录 B。4.2.2半选择性培养基用于栗黑水疫霉病菌游动孢子的萌发、菌株的纯化、病原菌的分离及再分离。配方参见附录B。4.2.3豌豆琼脂培养基用于培养栗黑水疫霉病菌菌丝丛，来刺激孢子囊的产生。配方参见附录B。5鉴定方法5. 1 症状检查仔细检查寄主植物的根颈部及茎基部,是否有根腐、颈腐、茎溃疡和坏死症状。观察围茎一周皮层是否出现变黑腐烂或有明显的棕色圆形病斑，散发酒糟味，潮湿条件下病部表面可长出白色菌丝。对可疑植物和繁殖材料的介质土送实验室用组织分离、植物材料诱集、土壤和介质诱集等方法进一步检验。5.2 组织分离将病株置于大烧杯或大型玻璃容器中,在自来水流水下冲洗1 h～2 h，选取新鲜的根或茎病组织，在病健交接处切取 0.5cm左右的小块，用 70%酒精消毒 1min，再用灭菌水浸洗10 s～20 s，用灭菌滤纸吸干水分后移至半选择性培养基，于25℃～28℃下培养5d。待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝,无隔多核,挑取菌丝尖端转移到基础培养基上25℃～28℃培养3d。5.3植物材料诱集在诱集前把感病植株组织润湿，在10℃～15℃，黑暗条件下保存等待处理。选取未成熟的有机苹果或梨,在上面挖直径8mm 的小洞,除去里面的果肉，每个苹果或梨以最多挖取 6个小洞为宜。把感病组织切成 1 cmX2 cm长,塞人洞中,洞的外缘应与苹果边缘平齐。如果感病组织非常细小,也可在苹果或梨上造成切口，把感病组织(如：树皮)插人切口中。把苹果或梨密封于塑料袋中，在室温下培养2 SN/T 2759—20114 d～6 d。观察在洞或切口附近是否出现明显的棕色病变区，而且检查腐烂病变是否质地较硬，如果相符，则取洞口或切口周