SN_T 1682-2010蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1682--2010代替SN/T1682—2005蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范Quarantine protocol for European foulbrood of honey bees2011-05-01实施2010-11-01 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范SN/T 1682—2010*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010址 www. spc. net. cn中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本 880×1230 1/16印张 0.755字数17千字2012年10月第一版2012年10月第一次印刷印数 1—1600*书号：155066·2-24069 SN/T 1682—2010前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准代替SN/T1682—2005《蜜蜂欧洲幼虫腐臭病诊断方法》。本标准修改采用了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2010版）中2.2.3.B中的诊断技术部分内容，涵盖了镜检、培养方法及聚合酶链反应法本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：王振国、陈世松、刘金华、宋战昀、蔡阳、苏琳、孟庆峰、朱开元、王建、魏春艳、王伟利。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：SN/T 1682-2005。I SN/T 1682--2010蜜蜂欧洲幼虫腐臭病检疫技术规范1范围本标准规定了密蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断方法。本标准适用于密蜂欧洲幼虫腐臭病诊断。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。一凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出境动物检疫采样3诊断原理蜜蜂欧洲幼虫腐臭病(Europeanl.faulbrad.of.honey.becs)是由蜂房蜜蜂球菌（Melissococcus pluto-nius)引起蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病，在蜂群迅速生长时多发，最常见的明显症状是密蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。大多数患病幼虫死前在巢房底部发生卷曲变形，许多患病幼虫很快被护理工蜂发现，清除，留下空巢房。未被工蜂清除的感染幼虫不久死亡变软，由浅黄色逐渐变成褐色，溶化成半液体状团块，然后干枯，形成深色鳞舟，很容易从巢房中取出。严重感染的幼虫有一种酸臭味。引起密蜂幼虫的死亡也有其他疾病和原因，因此野外依据观察临床症状不能做出可靠诊断。当依据临床症状疑似为欧洲幼虫腐臭病时,向取患病或死亡幼虫进行涂片染色镜检，做出初步诊断。在普通光学显微镜下，蜂房蜜蜂球菌是单个或成串或头尾相接成对或成短链状排列的短披针状球菌,大小为0.5 μm×1.0μm。确切的诊断需要进行细菌分离培养和染色镜检鉴定，或用半巢式聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction，PCR)对分离塔养物进行鉴定。/也可直接采用半巢式PCR检测患病或死亡幼虫来进行确诊。本标准中采用的半巢式PCR法，是根据蜂房蜜蜂球菌_16SrRNA基因设计对引物（MP1和MP2），进行第一次PCR扩增，扩增片段为486bp（参见附录A）。以该扩增基因为模板设计第三条引物（MP3），以 MP1和 MP3为引物进行第二次 PCR扩增，扩增片段为276 bp。4设备、材料与试剂4.1设备电泳仪、凝胶成像分析系统、高速台式冷冻离心机（最高转速12000r/min以上）、PCR扩增仪、普通光学显微镜、CO，培养箱等。4.2材料与试剂试剂配制方法参见附录B,所用水为按照GB/T 6682规定的--级水。所用试剂主要为DNA抽提缓冲液、CTAB沉淀液、1.2 mol/L氯化钠溶液、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、Taq DNA聚合酶、10×1 SN/T 1682—2010PCR 缓冲液、dNTPs(含 2.5 mmol/L dATP, 2.5 mmol/L dCTP,2.5 mmol/L dGTP,2.5 mmol/1dTTP）、10×氯化镁（25mmol/L）、10 μg/mLRNaseA、10 mg/mL溴化乙锭贮存液、相对分子质量标准品（100 bp～1000bp）、琼脂糖（电泳纯）、50×TAE电泳缓冲液、蜂房密蜂球菌标准菌株(Melissococcus pluton）、弓l物 MP1 5-CTTTGAACGCCTTAGAGA-3’、引物 MP2 5-ATCA