SN_T 1961.3-2012食品中过敏原成分检测方法 第3部分：酶联免疫吸附法检测荞麦蛋白成分.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1961.3—2012食品中过敏原成分检测方法第3部分：酶联免疫吸附法检测荞麦蛋白成分Detection of allergen compenents infood-Part 3 : Protocol of the Enzyme-linked immunosorbent assayfor detelting buckwheat protein component2012-05-07 发布2012-11-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局X数码防伪 SN/T 1961.3--2012前言本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分的起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、吉林省产品质量监督检验院。本部分主要起草人：刘金华、张舒亚、刘阳、宋战昀、魏春艳、孟日增、王振国、祝长青、史艳宇、吴连鹏。 SN/T 1961.3--2012食品中过敏原成分检测方法第3部分：酶联免疫吸附法检测荞麦蛋白成分1 范围SN/T1961的本部分规定了食品中过敏原养麦蛋百分的酶联免疫吸附检测方法。本部分适用于烘培类食品（饼干、面包、糕点等）、面条、（小麦、玉米）面粉、粥、豆粉、寿司、米粉等各种食品中过敏原荞麦蛋白成分的测定，本方法对标准荞麦蛋白定量检测范围:0.78ng/ml～50 ng/mL。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文A3.1过敏原allergen能够诱发机体发生过敏反应的抗原物质，又称为致敏原、变态反应原。3.2食品过敏原　food allergen普通食品中正常存在的天然或工添加物质.被过敏体质人群消费后能够诱发过敏反应。4原理本方法检测原理是抗原-抗体特异性结合反应，采用双抗夹心酶联免疫分析技术。微孔中包被有特异性抗荞麦蛋白的多克隆抗体.加人样品提取液后，样品中的荞麦蛋白即可特异地与微孔中的抗荞麦蛋白抗体结合。经过洗板去除没有结合的成分后，再加入生物素标记抗体，形成抗体-抗原-抗体复合物。洗去没有结合的生物素标记抗体，再分别加人链菌素-酶偶合物及显色剂进行颜色反应，使用酶标仪在450nm波长下对吸光度值测量。利用标准品的吸光度值对标准品浓度制作标准曲线，并通过标准曲线求得试样中荞麦蛋白含量。5试剂与材料5.1 水按照GB/T 6682规定的-级水。 SN/T 1961.3—20125.2荞麦酶联免疫吸附检测试剂盒参见附录 A。6仪器与设备6.1水浴锅：温度60℃±1℃6.2离心机：最大离心力大于或等于3000g。6.3酶标仪：测量波长450nm，参比波长600～650nm。6.4振荡器：振荡频率大于或等于100次/min。6.5　电子天平：感量0.01g。6.6微量可调单通道移液器：量程50μl.～200μl。6.7↑微量可调8通道移液器：量程100叫L～200μL。7　测定方法7.1试样的制备与处理7.1.1样品经充分研磨后，称取1g于50ml离心管中，加人19mL提取液（配制方法见7.2.2），充分振荡混勾。7.1.2调节其pH值在中性范围内（pH6.0～8.0）.将离心管水平置于振荡器中，室温下100次/min振荡过夜（至少12 h）。7.1.33000×g离心20 min取上清液。注：如有油层，要将其去掉，每个样品尽可能吸取相同体积的上清液。7.1.4将吸取的上清液用稀释液20倍稀释后用于测试。7.2试剂准备7.2. 1*实验前将适量的稀释液、终止液、底物（底物需要避光）从试剂盒中取出，平衡至室温（20℃～25 ℃)。7.2.2提取液配制，将提取液①/提取液②/提取液③/水按1：1：1：17比例混合，20倍稀释后备用。示例：对于24个样品的用量：提取液①(20×):25 mL;提取液@(20×）:25 mL;提取液③(20×）:25 ml;水:425 ml;总体积：500mL。7.2.3标准溶液配制，用稀释液20倍稀释提取液制成标准稀释液。用标准稀释液2倍系列稀释标准母液(50 ng/ml.),分别配制成 25 ng/ml、12.5 ng/mL、6.25 ng/mL、3.125 ng/mL、1.562 5 ng/ml、0.78125 ng/mL的标准溶液。7.2.4洗液，用水10倍稀释。7.2.5生物素标记抗体，用稀释液100倍稀释，15m