SNT 2120-2008流行性溃疡综合症检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2120-2008流行性溃疡综合症检疫技术规范Protocol of quarantine for epizootic ulcerative syndrome2009-03-16 实施2008-09-04 发布中华人民共和国发布1040国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T 2120—2008言前本标准修改采用国际兽疫局(OIE)《水生动物疾病诊断手册》2006版中第2.1.10章，对PCR中样品处理以及试验条件进行了调整和优化。本标准的附录 B是规范性附录,附录 A是资料性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。·本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：史秀杰、邱杨、何俊强、刘、高隆英、杨锦舜、江育林。本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 2120—2008流行性溃疡综合症检疫技术规范1范围本标准规定了各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的诊断方法。本标准适用于各种淡水与半咸水鱼流行性溃疡综合症的检疫。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008ISO3696:1987，MOD)3概述流行性溃疡综合症（Epizootic Ulcerative Syndrome）是由丝囊霉菌（Aphanomyces invadans 或者A.piscicida)引起的野生及养殖的淡水与半咸水鱼类的季节性流行病，也叫做红点病（RSD)、霉菌性肉芽肿（MG)、霉菌性溃疡(UM)，主要特征是在体表出现溃疡，骨骼肌中形成典型的霉菌性肉芽肿，简称EUS(参见附录 A)。4试剂和材料4.1水：用于 PCR(包括核酸抽提)的水要用 DEPC处理，以除去 DNA酶和 RNA 酶,其余用水应符合GB/T6682一级水的规格。4.2Taq酶：一20 ℃保存,不要反复冻融或温度剧烈变化。4.3 dNTPs:含 dCTP,dGTP、dATP.dTTP 各 10 mmoL/L。4.4引物:一对引物,浓度为 40 μmol/L。序列为：FP1 : 5-AAG-GCT-TGT-GCT-GAG-CTC-ACA-CTC-3FP2:5-GAT-GGC-TAA-GGT-TTC-AGT-ATG-TAG-3扩增丝囊霉菌 ITS1 rDNA 基因中的 98 bp 的 DNA 片断。扩增产物的参考序列：1 aaggcttgtg ctgagctcac actcggctag ccgaaggttt cgcaagaaac51 cgatgtacttttaatccctt taaactacat actgaaaccttagccatc4.5无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。4.610%福尔马林。4.7酒精：70%、80%、95%及无水酒精。4.8二甲苯。4.9中性树脂。4.10）石蜡。4. 11Harris 氏苏木精染液。4. 120.5%伊红酒精溶液。4.131%盐酸酒精溶液。 SN/T 2120—20085器材和设备5.1手术刀和镊子。5. 2载玻片和盖玻片。5.3 培养皿。5. 4恒温培养箱。5. 5普通冰箱和低温冰箱。5.6倒置显微镜。5.7研钵。5.8离心机和离心管。5.9微量移液器及吸头。5.10，PCR扩增仪。5.11 电泳仪。5. 12紫外观察灯或凝胶成像仪。5. 13标本缸。5.14包埋机。5.15切片机。6流行性溃疡综合症的诊断6.1诊断原则EUS的诊断基于出现临床症状后,并通过组织病理检查观察到特征性的霉菌性肉芽肿,或者从患病组织分离到丝囊霉菌（Aphanomyces invadans 或者Apiscicida）。6. 2 组织病理检查取有溃疡症状的活的或濒死的病鱼，用10%的福尔马林固定病鱼的皮肤和肌肉（1cm），包括坏死部位的边缘和四周的组织。固定好的组织按照常规石蜡切片方法制作切片，用苏木精-伊红（HE)或般的霉菌染色（如用Grocotts 染色)后封片，显微镜下观察。6.3 丝囊霉菌 Aphanomyces invadans(或 A. piscicida)的分离取有溃疡症状的活的或濒死的病鱼，用无菌刀片从溃疡的边缘横切2片下来。用烧红的刀片消毒暴露的肌肉表面，用无菌小刀从溃疡下部切一圆形2mm²～4mm²的小块，放到加有 100IU/mL青霉素和 10 μg/mL 喹酸的 GP 肉汤(见附录 B第 B.1章)平板中,工具不要碰到鱼