SNT 1695-2006马焦虫病微量补体结合试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1695—2006马焦虫病微量补体结合试验操作规程Protocol of complement fixation microtitration test for equine piroplasmosis2006-01-26 发布2006-08-16 实施中华人民共和国0发布数码防伪国家质量监督检验检疫总局 SN/T言本标准主要依据OIE《诊断试剂和疫苗标准手册》(2004)第五版第2.5.6章制定。本标准的附录A、附录B、附录C均为规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：简中友、付蕾、胡传伟、孙延峰、苏永生、孙颖杰。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1695—2006马焦虫病微量补体结合试验操作规程范围1本标准规定了马焦虫病微量补体结合试验的操作方法。本标准适用于马属动物马焦虫病的血清学诊断。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3试剂和材料3.1 试剂3.1.1试验用蒸馏水为GB/T 6682中的三级水。3.1.2稀释液：巴比妥缓冲液（见第A.2章）。3.1.3补体结合抗原：由指定单位提供，按说明书使用。标准阳性血清：由指单位提供，按说明书使用。3.1473.1.5标准阴性血清：由指定单位提供，按说明书使用。3.1.6溶血素：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积，3.1.7补体：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。3.1.8绵羊红细胞储存液：选健康成年绵羊，无菌颈静脉采血，1.2份阿氏液（见第A.1章）加1份血液，混匀,2℃～8℃保存，2,调内使用。3.2被检血清3. 2. 1 采血和分离血清按常规方法采集静脉血，无菌分离血清。血清必须新鲜，无蛋白絮凝物、无溶血、无腐败气味。3.2.2运送和保存血清血清采用冷藏运送。若3tl 内不能送到实验室，用冷冻方法运送。3.3材料3.3.1玻璃试管：10mim×75mm，圆底洁净反应管。3.3.2试管架。3.3.3微量移液器。3.3.4可调连续加样器3.3.596孔“U”型微量板。4操作方法4.1预备试验4.1.13%红细胞悬液的制备绵羊全血充分混匀后，取所需量用稀释液洗三次，每次 2000 r/min离心5min，最后一次离心 10 min。1 SN/T 1695—200取1份红细胞泥加人到24份稀释液中，充分混匀，制成红细胞悬液。取出250μL红细胞悬浮液加人到4.75mL蒸馏水中，充分裂解（液体清亮）。取100L加人到96孔微量板孔内，平行加8个孔。用酶标仪于540nm波长下读光密度值（OD值），算出平均OD值，代人校正红细胞浓度公式,见式(1)：稀释液加人量 = 平均 OD值 ×红细胞悬液量 /0.115一红细胞悬液量....(1 )取校正红细胞浓度时所需的稀释液量加入到红细胞悬液中即得 3%红细胞悬液。4.1.2溶血素效价的测定稀释溶血素取0.2mL溶血素原液，加人到19.8mL生理盐水中，制成1：100倍稀释的溶血素，再按表1稀释成不同稀释倍数的溶血素。表 1 溶血素的稀释单位为毫升1 +3 0001 : 5 0001 : 10 000稀释倍数1 : 5001 : 1 0001 : 1 5001 : 2 0001 : 1001: 1001 +1001 : 1001:10001 : 1 0001: 1000溶血素量溶血素 1. 0溶血素1. 0溶血素 1.0溶血素2.0溶血素 0.5溶血素 0.5溶血素 1. 0 7. 09. 52. 04.09.0巴比妥缓冲液4.018. 0制备不同稀释倍数的溶血素致敏红细胞取7个试管,每管加1.5mL3%的红细胞悬液，然后分别缓慢加人不同稀释倍数的溶血素1.5mL，混匀，37℃水浴箱中感作15min。溶血素效价的确定将补体原液预稀释至1：150,按表2于96孔U”型微量板上测定溶血素效价。表 2 溶血素效价测定单位为微升2567孔号34150505050505050稀释液2525252525 25251：150补体505050 505050 50不同稀释倍数致敏红细胞1 : 5 000 1: 10 0001 : 5001*1 0001: 15001: 2 0001:3000溶血素稀释倍数感作37℃水浴振荡30min(每隔5min振荡1次，下同)2000 r/min水平离心3min,取