SN_T 2596-2010番茄细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T茄细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudomonas syringaepv. tomato (Okabe) Young et al.12-01实施2010-05-27发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局GR数码防伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准番茄细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法SN/T2596-2010*中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16号邮政编码：100045网址电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.75字数15千字2010年10月第一版2010年10月第一次印刷印数1—1600*书号：155066·2-21198- SN/T2596—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局。本标准主要起草人：刘鹏、王金成、赵文军、吴志毅、丁翠珍、刘跃庭、郭京泽。 SN/茄细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法1范围本标准规定了进出境植物检疫中番茄细菌性叶斑病菌的检疫鉴定方法。本标准适用于进出境番茄及辣椒等植物种子及其产品中番茄细菌性叶斑病菌的检疫和鉴定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1538.1培养基制备指南第1部分：实验室培养基制备质量保证通则SN/T1809进出境植物种子检疫规程3原理番茄细菌性叶斑病菌属原核生物界（Procaryotes），薄壁菌门（Gracilicutes），假单孢菌科（Pseudomonaceae），假单孢菌属（Pseudomonas），该病菌的生物学特性、血清学特性及分子生物学特性是制定本标准的主要依据（参见附录A）。4仪器和用具生物显微镜、超净工作台高压灭菌器、酶标仪、恒温培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统及其他常规实验室设备及器具。5试剂除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB6682中一级水的规格。培养、鉴定番茄细菌性叶斑病菌所用的试剂见附录B、附录C和附录D。6检疫鉴定方法6.1田间调查及植株检验田间调查时采集具可疑症状的植株或果实带回实验室，用清水冲洗干净，晾干后用灭菌的解剖刀在病键交界处取一小块病变组织，悬浮于少量无菌水中，用无菌玻棒挤压，然后用接菌环蘸取菌悬液，在KB培养基平血上划线分离，28℃恒温培养48h，根据番茄细菌性叶斑病菌的菌落特征选取可疑菌落做进一步鉴定，也可用发病果实或茎秆作ELISA检测实验。6.2种子处理随机抽取30g（≥10000粒）番茄种子为一份样品（少于30g的番茄种子样品则全部抽取，具体抽 SN/T 2596—2010样要求参见SN/T1809），加150mL预冷的0.05mol/L、pH7.2的磷酸-吐温缓冲液（PBT）。摇匀使种子完全湿润，在室温真空条件下孵育30min～60min，慢慢恢复常压；或在4℃下磁力搅拌器上搅24h~48h，取50mL样品抽提液，12000g离心10min浓缩，弃上清液，加入1mL0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.2)重新悬浮，悬浮液进行DAS-ELISA检测。6.3双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA)具体检测步骤及判定方法见附录C。若检测结果为阳性，进行6.3及后续操作；若检测结果为阴性，可判定供试样品为阴性。6.4病菌的分离取6.1中番茄种子抽提液进行系列浓度稀释，稀释倍数分别为10倍，100倍，1000倍，10000倍；将各浓度稀释液在KB培养基平皿上进行涂布，50μL/平皿，每个浓度至少涂三个平皿，28℃培养48 h.根据附录A中病菌在KB培养基上的菌落特征，挑取可疑的单菌落，连续转接2次进行纯化。对纯化的可疑菌株进行6.5步骤操作。6.5PCR方法具体实验步骤和试剂配制见附录D。采用特异性引物P1/P2对可疑菌株进行PCR检测，以番茄细菌性叶斑病菌标准菌株作阳性对照，以非番茄细菌性叶斑病菌的植物病原细菌作阴性对照，以水作空白对照，进行PCR扩增，扩增产物进行电泳分析。若可疑菌株与阳性对照在650bp处有条带，阴性对照与空白对照无条带出现，可判定检测结果为阳性。7结果判定在血清学检测中，若ELISA法检测结果为阳性，可初步判定为检出番茄细菌性叶斑病菌所分离的细菌菌株菌落特征