SN_T 3824-2014化妆品光毒性试验 联合红细胞测定法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3824——2014联合红细胞测定法化妆品光毒性试验Cosmetics phototoxicity test--Red blood cell assay(photohaemolysis and haemoglobin oxidation)2014-08-01实施2014-01-13 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3824—2014前言本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：史喜菊、马贵平、曾静、柏亚铎、程树军、刘全国、李炎鑫、李冰玲。一 SN/T 3824-2014联合红细胞测定法化妆品光毒性试验1范围本标准规定了化妆品光毒性试验的联合红细胞测定法操作规程，包括红细胞溶血试验和血红蛋白氧化试验。本标准适用于化妆品原料及其终产品的体外光毒性试验的筛选和检测。本标准可作为光毒性试验的一部分，结合其他替代试验和动物实验对受试物的光毒性进行整体评价。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡缇注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版苯(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用永规格和实验方法1GB/T 21769　化学品体外3T3中性红摄取光毒性试验方法SN/T 2285化妆品体外替代试验实验室规范3术语和定义下列术语和定义适用于本文3.1光毒性 phototoxicity皮肤第一次接触某种化学物质继而暴露于光下所引发的一种急性毒性反应，或者全身应用一种化学物质后，暴露于光下所发生的类似于皮肤照射的友应。3.2辐照度　irridance照射到某表面的紫外线（UV)或可见光（Vis)的强度：单位为瓦每平方米（W/m²），或者毫瓦每平方厘米（mW/cm²）。3.3光照剂量dose of light照射到某--表面的紫外线或可见光的量（强度×时间），单位为焦耳每平方米（J/m²），或者焦耳每平方厘米(J/cm²）。3.4光溶血 photohaemolysis在有光毒性物质存在时，红细胞受紫外线或可见光照射后发生溶解，其溶解程度可以通过测定释放到上清液中的血红蛋白量来确定，即540 nm处的光密度值。3.5血红蛋白氧化haemoglobin oxidation在有光毒性物质存在时,红细胞受紫外线或可见光照射后可以造成血红蛋白氧化,形成高铁血红蛋11 SN/T 3824--2014白。因此，血红蛋白氧化也称高铁血红蛋白形成（methaemoglobin information，MetHb information），血红蛋白氧化值也称高铁血红蛋白形成值，可以通过用Triton X-100溶解剩余细胞并测定其630 nm处的光密度值来得到。3.6H5o 50% haemolysisH5指的是50%溶血值，能使红细胞出现50%溶血的被试物质的浓度。3.7F(+ /-) haemolysis factorF（十／一)指的是溶血因子,可以预测被试物质光毒性潜能，等于避光板和光照板的 H5o之比。3.8DODdelta OD(max)表示高铁血红蛋白的最大形成值，可以预测被试物质的光毒性潜能。4　方法原理在有光毒性物质存在时,红细胞受辐照后可以造成血红蛋白氧化(形成高铁血红蛋白)和红细胞溶解。化合物的光毒性潜力可以通过测定该化合物在紫外光(UV)和可见光(太阳光)照射下对红细胞膜损伤和/或氧化血红蛋白(蛋白质相关的光损伤)的能力来评价。其中，红细胞溶解程度可以通过测定释放到上清液中的血红蛋白量来确定，即540 nm处的光密度值；血红蛋白氧化可以发生在溶解后的细胞外，也可以发生在细胞内，总的血红蛋白氧化能力（高铁血红蛋白形成值）可以通过用Triton X-100 溶解剩余细胞并测定其630 nm处的光密度值来得到。5主要设备5.1酶标仪（波长范围 400 nm～750 nm）。5.2光源（太阳光模拟器，配备500W的金属卤化物灯和305nm的H²灯栅，如SOL500,Honle，Mu-nich,Germany)。5.3辐照计（光照强度 UVA=1.67 mW/cm²,UVB=0.1 MW/cm²；照射 150 min 后，UVA 剂量15 J/cm²，UVB剂量1 J/cm²,如 Honle,Munich,Germany)。5.4离心管(10 mL)。5.524孔细胞培养板（Nunc)。5.6微量板离心机。5.7微量可调移液器（2μL、10 μL、100 μL、1000 μL)及相应的吸头。6试验准备6.1红细胞的制备：采集人或者其他哺乳动物（如牛、