SN_T 2694-2010牛胎儿毛滴虫检验方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2694—2010牛胎儿毛滴虫检验方法Protocol of detection for Tritrichomonas fetus in bovine2010-11-01发布2011-05-01实施中华人民共和国发布30国家质量监督检验检疫总局数码防伪 SN/T2694—2010前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准修改采用了OIE《哺乳动物、禽、蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册》（2006版）的有关章节，参照了加拿大动物疾病研究所的操作规程。本标准由认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张立怀、王建华、陈本龙、霍蕾、侯艳梅。 SN/T2694—2010牛胎儿毛滴虫检验方法1范围本标准规定了牛胎儿毛滴虫的病原鉴定和PCR检测方法。本标准适用于进出口牛、牛精液中胎儿毛滴虫的检疫。也适用于牛场胎儿毛滴虫病的监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述胎儿毛滴虫（Tritrichomonasfetus）引起牛生殖道毛滴虫病，造成奶牛流产和不育。牛是胎儿毛滴虫的自然宿主，猪、马、獐也可能是它的自然宿主。在肉牛群中，或在人工授精技术尚未广泛应用的地方，该病仍然十分严重。该病是世界动物卫生组织规定的二类病。该病原体有三个血清型，分别是贝尔法斯特型、曼利型和布里斯班型，都具有同等的致病力，该病主要经交嫌传播，也能通过人工授精或产科检查传播。4设备与器材4.1采样管和吸球，采样管为中空的塑料长管，采样端钝，另一端可与吸球相连。4. 2剪刀、记号笔、一次性手套、防护服、吸水纸、桶、消毒液。4.3生物安全柜。培养箱。4.44.5普通生物显微镜。4.6台式离心机。4.7基因扩增仪。4.8水浴锅。4. 9涡旋振荡器。4.10冰箱。4.11琼脂糖凝胶电泳仪。4. 12凝胶成像分析系统。5培养基及试剂除特殊说明外，试验用水应符合GB/T6682规定。5.1胎儿毛滴虫运输培养基（TFTM)（见附录A.1）。5.2胎儿毛滴虫培养基：Diamond培养基（见附录A.2）。5.3吉姆萨染液（见附录A.3）。 SN/T2694—20105.4裂解液（见附录A.4)。5.5酉酚/三氯甲烷/异戊醇25：24：1。5.63mol/L乙酸钠（见附录A.5）。5.7TE缓冲液。5.8阳性对照：由指定单位供应。6样品采集6.1公牛的阴茎包皮清洗液的采集公牛用六柱栏保定，用绳子固定采样侧的后肢，剪短阴筒外面的阴毛，用清水洗净公牛的尿道口，并用纸擦干。将采样管的采样端插人阴筒内，将另一端的吸球压扁，用10mL预热至35℃左右的生理盐水反复冲洗，吸取冲洗液。取出采样管，迅速将冲洗液注入无菌15mL离心管中。将采样管放入消毒液中。冲洗液静置15min～20min，用一次性吸管吸取底部液体1mL，分别注人两瓶TFTM中，0.5mL/瓶。18℃～37℃条件下，尽快送至实验室。6.2母牛的生殖道清洗液、阴道粘液的采集母牛六柱栏保定，用清水洗净牛的外阴部，将采样管的采样端插入阴道内，用10mL预热至35℃左右的生理盐水冲洗，将另一端的吸球压扁并来回抽动，吸取阴道粘液。取出采样管，迅速将冲洗液注入无菌15mL离心管中。将采样管放入消毒液中。冲洗液静置15min20min，用一次性吸管吸取底部液体1mL，分别注人两瓶TFTM中，0.5mL/瓶。18℃～37℃条件下，尽快送至实验室，6.3流产的胎儿样品采集无菌采取胎儿的胃内容物1mL，0.5mL/瓶，分别注入两瓶TFTM中，18℃～37℃条件下，尽快送至实验室。6.4精液的采集人工采集的新鲜或冷冻精液，取1mL置2瓶TFTM中，0.5mL/瓶。尽快送至实验室。7虫体的培养与镜检7.1样品送至实验室后，立即对样品进行离心，2500r/min，离心10min，不弃上清液，无菌从管底取1滴～2滴沉淀物至载玻片上，不盖盖玻片，10×镜下观察。7.2如未发现虫体，另取2滴～3滴沉淀物接种到含10mLDiamond培养基的试管中。接种时，应将沉淀物接种在培养液的上层近液面处。37℃培养7d。7.3分别在第2、4、5、7天从管底部取一滴检查。检查方法同7.1。7.4发现虫体后，推荐用吉姆萨染液染色后观察。将待检样品取一滴，置于载玻片一端，用另一片载玻片推成薄膜，室温下干燥，用甲醇固定2min，将载玻片浸人含吉姆萨染色液的染色缸中，染色30min。取出后，吸干多余染液，在40×倍物镜下观察。8虫体的鉴定8.1形态学鉴定胎儿毛滴虫是一种有鞭毛