NY 556-2002鸡传染性喉气管炎诊断技术.pdf

ICS_11. 220B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 556—2002鸡传染性喉气管炎诊断技术Diagnostic techniques for avian infectious laryngotracheitis2002 - 08~ 27 发布2002- 12- 01 实施中华人民共和国农业部5发布 NY/T 556—2002前言鸡传染性喉气管炎是鸡的重要疫病之一，世界动物卫生组织［World Organization for AnimalHealth（英）Office International des Epizooties（法）,OIE将本病定为B类动物疾病，我国定为二类动物疫病。本标准主要参照OIE推荐的鸡传染性喉气管炎(ILT)诊断方法制定。本标准的附录 A、附录B为规范性附录。本标准由农业部畜牧兽医局提出。本标准由全国动物检疫标推化技术委员会归口。本标准起草单位：农业部动物检疫所。本标准主要起草人：范根成、王永玲、刘相娥、王红。 NY/T 556—2002鸡传染性喉气管炎诊断技术1范围本标准规定了鸡传染性喉气管炎病毒分离及琼脂凝胶免疫扩散试验的技术要求。本标准规定的病毒分离技术，适用于本病的确诊。琼脂凝胶免疫扩散试验，适用于传染性喉气管炎的血清学诊断及用传染性喉气管炎疫苗免疫后的抗体检测。2病毒分离鉴定技术2.1材料准备2. 1. 1 病料的准备2.1.1.1活体采样：用灭菌棉拭子伸人口咽或气管采集分泌物，放人含青素4000IU/mL，链霉素4000 μg/mL的无菌生理盐水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，处理方法同上。2.1.1.2尸体采样：无菌采取病死鸡喉头和气管，放人无菌的平皿或烧杯中，密封。2.1.2样品的运送采集的样品应立即放人4C冰箱保存，24h内送到实验室；不能在24h内送到实验室时，应将所采样品冷冻保存和运输。2.1.3样品处理2.1.3.1收到棉拭子样品后，先经冻融两次，并充分振动、挤干棉拭子，将样品液经10000r/min离心10min，取上清液，加人青霉素4000IU/mL，链霉素4000μg/mL，于37C作用30min，作为接种材料。2.1.3.2组织样品：无菌条件下将组织剪碎，按1：4加人生理盐水后用研磨器研磨制成20%的勾浆悬浮液，再经10000r/min离心10min，取上清液，加人青霉素4000IU/mL，链霉素4000μg/ml.，于37℃作用30 min，作为接种材料。2.2操作方法2.2.1样品接种取经处理过的样品,接种 9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜。每枚0.2mL,接种后的鸡胚在 37℃孵育，每天观察鸡胚2次,连续观察7d，弃去24 h内死亡的鸡胚，24 h～120h内死亡的鸡胚，放 4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成；120h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4C冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。有痘斑者，取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨后，置一20℃冻存备用；无痘斑者,亦取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨，反复冻融，离心后，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜盲传。如此育传3代以上，如仍无病变，则判为鸡传染性喉气管炎阴性。2.2.2病毒鉴定病毒分离物的鉴定：用鸡传染性喉气管炎标准阳性血清(效价在1：32以上)和标准阴性血清与分离物作鸡胚中和试验，固定血清,稀释病毒法中和试验操作方法。血清处理:将传染性喉气管炎标准阳性血清和标准阴性血清56C灭活处理30min。病毒稀释：将病毒分离物用含青霉素1000 IU/mL、链霉素1000 μg/mL的灭菌生理盐水稀释，稀释方法见表1。1 NY/T 556—2002表 1 病霉分离稀释方法管号病毒分离物稀释度试管中的混合液12×10-11mL 病毒分离物原液＋4 mL稀释液22×10-21mL 2号管液＋9mL稀释液32X10-31mL3号管液＋9mL稀释液42X10-41 mL 4号管液＋9 mL稀释液52×10-s1mL5号管液＋9mL稀释液病毒-血清混合液：设两排试验管,每排 4个管,第1排每管放 0.6 mL标准阳性血清,第2排每管放0.6mL阴性血清，然后向每排1～4号试验管内分别加人(2×10-²～2×10-§)稀释的病毒悬液各0.6mL,将病毒-血清悬液混合并置冰箱(4℃～8℃)4 h。鸡胚接种及结果判定:取经处理过的病毒-血清混合液，分别接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜，0.2mL/枚，每管接种5枚，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d,弃去24h内死亡的鸡胚,24 h～120 h 内死亡的鸡胚,放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成;120 h 仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。记录观察结果，按半数致死量(Reed-Mue