NYT 674-2003转基因植物及其产品检测 DNA提取和纯化.pdf

ICS 65. 020. 99B 20NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 674-2003转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化Detection of genetically modified plant organisms andderived products--DNA extraction and purification2003-04-01发布2003-05-15实施中华人民共和国农业部发布 NY/T 674-2003前言本标推由农业部科技教育司提出。本标推起草单位：中国农业科学院生物技术所、中国农业科学院植物保护研究所、上海市农业科学院、农业部科技发展中心、中国农业大学。本标准主要起草人：贾士荣、金芜军、张大兵、彭于发、黄昆仑、李宁、汪其怀、罗云波。本标准首次发布。 NY/T 674--2003转基因植物及其产品检测DNA提取和纯化1 范围本标规定了转基因植物及其产品中DNA提取和纯化的方法和技术要求。本标准适用于转基因植物及其产品中DNA的提取和纯化。2规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。NY/T 672转基因植物及其产品检测通用要求NY/T 673转基因植物及其产品检测抽样3原理通过物理和化学方法使DNA从样品的不同组分中分离出来。利用不同的纯化方法，弃除样品中的蛋白质、脂肪、多糖及其他次生代谢物，及 DNA提取过程中加人的三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇和乙酸钠等，获得纯化的DNA。4 试剂与溶液除非另有说明，在分析中仅使用分析纯试剂；配制好的溶液经高灭菌后使用。4.1 溴代十六烷基三甲胺(cetyltrimethyl ammonium bromide,CTAB)。4.2三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl) aminomethane,Tris了。4. 3 二水乙二胺四乙酸二钠(ethylenediamine tetraacetic acid,disodium salt,dihydrate,EDTA-Na ·2H,0).4. 4 E-巯基乙醇(E-mercaptoethanol)。4.5三氯甲烷(chioroform)。4. 6 异戊醇(isoamyl alcohol)。4. 7 异丙醇(isopropyl alcohol)。4.8三氯甲烷十异戊醇=24十1(体积比)。4.976%乙醇溶液：取760 mL无水乙醇,如水定容至1L。4.1070%乙醇溶液:取700 mL无水乙醇，加水定容至1L4.11CTAB提取缓冲液I：配制每升CTAB提取缓冲液I，应在800mL去离子水中加人46.75g氯化钠，摇动容器使溶质完全溶解，然后加人50mL1mol/LTris-HCI(pH8.0)[在800mL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),冷却至室温后用浓盐酸调节溶液的pH值至8.0(约需 42 mL浓盐酸）,加水定容至 1L，分装后高压灭菌了,20 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0)L在 800 mL水中加人186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na·2H2O)，在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用氢氧化钠（NaOH)1 NY/T 674--2003调节溶液的pH值至8.0(约需20g氢氧化钠颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌了,用水定容至1L，分装后高压灭菌。4.12CTAB提取缓冲液IⅡ：配制每升CTAB提取缓冲液I，应在800mL去离子水中加入46.75g氯化钠,20 g溴代十六烷基三甲胺（CTAB)，摇动容器使溶质完全溶解，然后加人1mol/L Tris-HCI(pH8.0)50 mL,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL,用水定容至1 L，分装后高压灭菌。4.13乙酸钠溶液：配制每升乙酸钠溶液，应在800mL水中溶解 408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调节pH 值至 5.2,加水定容至 1 L,分装后高压灭菌。4.14 RNase A:将 10 mg 胰 RNA酶溶解于 987 μL 水中,然后加 1 mol/L Tris-HCl(pH7. 5)10 μL[在800 mL去离子水中溶解121.1g三羟甲基氨基甲烷(Tris),加人 60 mL浓盐酸,冷却至室温后调节pH值至7.5,加水定容至1L,分装后高压灭菌］,5mo1/L氯化钠3μL(在800mL水中溶解292.2g氯化钠，加水定容至1L，分装后高压灭菌），于100℃水浴中保温15min，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于--20℃。4.15TE缓冲液：配制每升 T