SN 1395.1-2004禽衣原体间接红细胞凝集试验方法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1395.1—2004禽衣原体间接红细胞凝集试验方法Protocol of indirect hemagglutination test for avian chlamydiosis2004-12-01实施2004-06-01发布中华人民共和国15157发布【数码防伪，国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1395.1-2004前言本标准的附录 A是规范性附录。本标由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局。本标准主要起草人：梁刚、张云桥、陈泽华。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。 SN/T 1395.1—2004禽衣原体间接红细胞凝集试验方法1范围本标准规定了禽衣原体间接红细胞凝集试验方法本标准适用于禽衣原体病的流行病学调查、诊断和蓝测。2 采样本试验检测样品为禽鸟类动物血清。样品应无菌采集，且不溶血、不腐败。样品4℃时可保存5d，长期存样应~18℃冷藏保存，试验前56℃水浴灭能30min～35min。3材料3.1器材恒温水浴箱，96孔V型微量反应板，25μL、50μuL微量移液器，微量振荡器，超净工作台，恒温培养箱，高压消毒器，台式离心机，离心管。3.2稀释液含1%灭能兔血清的pH7.0磷酸缓冲液(PBS)，配制方法见附录A，或按诊断试剂说明书配制。3.3诊断试剂敏化红细胞,标推阳性血清,标准阴性血清。4　方法每份被检血清倍比稀释至第6孔，每次检测设一对照试验组，包括敏化红细胞空白对照、阳性及阴性血清对照试验，试验操作程序见表1。表 1禽衣原体间接红细胞凝集试验操作程序及结果判定举例被检血清稀释度各项对照试验成分阳性血阴性血1 :21:41+81 : 161 : 321 t 64空白对照清对照清对照5050150150 )501稀释液/μL50150)50J50 ]--.50 J-50 J50]50元被检血清/μL弃去50阳性对照50血清/μL阴性对照50血清 /μL敏化红25252a252525252525细胞/μL置反应板于微量振荡器上振荡1min,37℃或室温感作结果判++++++++定举例注：所示被检血清红细胞凝集效价为 1 132。 SN/T 1395. 1—2004被检血清检测程序如下：每孔滴加稀释液50μL;-将被检血清50μL加人第1孔，依次作倍比稀释至第6孔，最后弃去50uL一每孔加入敏化红细胞25μL；置反应板于微量振荡器上振荡 1 min,混勾;-将反应板加盖，37℃或室温感作30 min～120min，以对照孔出现结果时判读。5结果判定5.1凝集程度的判别标准和红细胞凝集效价5.1.1凝集程度的判别标准十十十十:红细胞全部凝集，成一均匀的膜,布满整个孔底。十十十:红细胞在孔底形成一层薄膜，面积比前者小。十十：红细胞在孔底形成薄层凝集，边缘松散或呈锯齿状。十：红细胞在孔底呈小圆点，周围有稀疏散在的少量凝集。土:红细胞沉于孔底,但周围不光滑或中心有空斑一;红细胞完全沉于孔底，呈光滑的圆点。5.1.2红细胞凝集效价被检血清产生“十十”红细胞凝集现象的最高稀释倍数为红细胞凝集效价。5.2结果判定5.2.1对照试验敏化红细胞空白对照：应无自凝现象，为（一）。阳性对照血清：应为（十十十十）。 阴性对照血清:应为（-）。5.2.2检测判定被检血清检测结果按以下标准判断：红细胞凝集效价为1：16 及以上，判为阳性;红细胞凝集效价为1；4及以下，判为阴性；红细胞凝集效价介于两者之间的，判为可疑。被检血清如出现可疑结果的，应作复检，复检结果仍为可疑的，判为阳性。2 SN/T 1395. 1--2004附录A（规范性附录）稀释液配制A. 1 pH7. 0 磷酸缓冲液(PBS)氯化钠(NaCl)4.25 g磷酸氢二钠(Na² HPO·12H2O)16.41 g3.97 g磷酸二氢钾(KH²PO.)以上试剂应选用分析纯，将上述成分溶解于适量蒸馏水中，最后定容至1000 mL，121℃0.103MPa20min高压灭菌，4℃保存,30d内使用。A.2 免血清处理A.2.1绵羊红细胞的制备取新鲜脱纤维或抗凝保存的绵羊红细胞，用PBS 1 500 r/min～2 000 r/min 离心洗涤四次，每次PBS用量为红细胞压积的5倍以上，最后一次2000r/min离心10min，去除上清液，制得密集绵羊红细胞。A. 2.2兔血清处理取三只以上健康家兔的血清混合，56℃水浴灭能30min，加人四分之一血清容积的密集绵羊红细胞，混匀，37℃水浴60min，其间摇匀数次，4℃过夜，次日离心除去红细胞，18℃冷藏保存备用。A.3稀释液配制1 mL经处理的兔血清加人到99mL的PBS中，混匀即为本试验的稀释液。稀释液现配现用。 100260