SN_T 4877.3-2017基因条形码筛查方法 第3部分：检疫性植原体.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 4877.3—2017基因条形码筛查方法第3部分：检疫性植原体DNA barcoding screening method--Part 3 :Quarantine phytoplasma2018-03-01实施2017-07-21 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局刮涂层查真伪， SN/T 4877.3—2017前言SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：一第1部分：检疫性棒形杆菌；-第2部分：检疫性黄单胞菌;第3部分：检疫性植原体。本部分为SN/T4877的第3部分。本部分按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国广西出入境检验检疫局、福建省农业科学院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、李为民、杜智新、谢丽雪、田茜、廖芳。1 SN/T 4877.3—2017基因条形码筛查方法第3部分：检疫性植原体1范围SN/T 4877的本部分规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA 提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。本部分适用于检疫性植原体的筛查鉴定。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1DNA 条形码生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。2.216S rRNA 基因原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，16S rRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，在植原体的分类鉴定中广泛应用。2.3 tuf 基因延伸因子基因，是植原体转录过程中的关键因子，为单拷贝，序列相对保守，常用于植原体的分类鉴定。3植原体基本信息为软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属（Candidatus phytoplasma）。检疫性植原体的具体信息参见附录A。4　方法原理16S rRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及 tuf 基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。5仪器用具及试剂5.1仪器用具PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、冰箱、1 SN/T 4877.3---2017旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。5.2试剂植物DNA 提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA marker。核酸提取研磨液(100 mL):K² HPO4·3H²O,2.17 g;KH²PO,0.41 g;蔗糖,10 g;BSA(FractionV)，0.15 g;PVP-10,2 g。pH 7.6高温灭菌,4℃保存。DNA 提取液:Tris-HCl,100 mmol/L;EDTA,100 mmol/L;NaCl,250 mmol/L;调 pH 至 8.0。50 XTAE:2.0 mmol/L Tris,1.0 mmol/L NaAc,50 mmol/L EDTA,pH 8.0.6筛查鉴定方法6.116S rRNA 基因序列扩增测序利用通用引物进行16SrRNA基因序列扩增测序（具体步骤见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物 DNA条形码鉴定数据库中进行blast 比对。6.2虚拟 RFLP指纹图谱分析见附录 B。6.3tuf 基因序列扩增分析见附录 C。7．结果判定根据16S rRNA基因序列blast 比对结果进行初步判定。如果相似度高于97.5%,初步判定为一个候选种或组。根据iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FP Cluster软件分析结果进行判定。相似度达到0.85时,判定为同一个组,0.85～0.97之间为不同亚组，然后根据名录中检疫性植原体对应的组或亚组进行判定。也可以利用 tuf 基因序列在欧盟检疫性有害生物鉴定数据库（QBOL)或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中比对判定，NJ 树聚在同一支上为同一组或亚组。筛查鉴定结果需结合寄主、症状及病原形态等生物学信息进行最终判定。8样品保存与复核8.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后需经高压灭菌后方可处理。8.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时