SN_T 2865-2011尼帕病毒病检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2865--2011尼帕病毒病检疫技术规范Protocol of quarantine for Nipah virus disease2011-12-01实施2011-05-31发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2865—2011前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)《陆生动物诊断试验与疫苗标准手册》（2004版）2.10.10条“亨得拉和尼帕病毒病”。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：朱来华、梁成珠、郑小龙、岳志芹、肖西志、邓明俊、谭乐义、辛学谦。 SN/T 2865—2011尼帕病毒病检疫技术规范1 范围本标准规定了尼帕病毒病的病毒分离鉴定、电镜观察、免疫组织化学试验、微量血清中和试验、酶联免疫吸附试验等检疫方法。本标准适用于进出境动物尼帕病毒病的检疫。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述3.1 尼帕病毒(Nipah virus,NiV)病是一种新出现的人畜共患传染病。尼帕病毒病的病原是副黏病毒科(Paramyxoviridae)成员，能够感染人、猪等多种动物。在猪群内传播迅速，症状却不明显，在人群中有人传人的可能,并且人感染 NiV之后,死亡率高达 40%～70%。3.2NiV 可以感染各个年龄段的猪，不同类别的猪表现出不同的临床症状，例如母猪首先表现为神经症状，而肉用猪表现为呼吸道症状，此外，圈养的母猪和公猪活动受到限制，可能掩盖其呼吸道症状。3.3人、猫、狗和马也可以感染 NiV。人感染 NiV 后，多数以神经症状为主，也可以呼吸道症状为主，死亡率很高；狗感染 NiV后，可出现类似犬瘟热症状；猫感染 NiV 后，死亡率很高；马感染 NiV后可以出现神经症状，但是死亡率似乎较低。所以在临床诊断时，应注意感染的猪场及其周围人和其他动物的发病情况，注意发病猪场新近是否引进新猪。因尼帕病毒病是可感染人和多种动物的人畜共患传染病，所以处理带有或可能带有此活病毒的样品必须在BSL-4 生物安全实验室内操作。3.4死后剖检发现 NiV 感染猪没有特征性病变,肺和脑膜是主要的病变器官。大多数病例表现由轻微到严重的肺部病变，包括程度不同的实变、气肿、淤血性溢血以及呼吸道有带血丝的分泌物，切开肺部,可见肺小叶间隔肿胀。脑膜弥漫性充血、水肿，其他的内脏器官没有明显的变化。4 病毒分离鉴定4.1试剂、材料与仪器4.1.1试剂与材料：Vero 细胞或RK-13 细胞、EMEM或其他培养基、抗生素贮存液、细胞消化液、细胞培养液和细胞维持液、细胞瓶和各种常规试剂等（见附录A）。试验用水应符合GB/T 6682要求。4.1.2仪器：生物安全柜或超净工作台、倒置显微镜、高速冷冻离心机、二氧化碳培养箱、高压灭菌锅等。4.2样品采集与处理4.2.1样品采集与运送：无菌采集动物脑、肺、肾和脾脏等组织，4℃保存运送到BSL-4级生物安全实 SN/T 2865-2011验。也可用干冰保存运送，但病料不能长期存放在一20℃。4.2.2样品处理：无菌处理样品，样品称量，置于无菌密闭容器内，加人少量组织培养液和抗菌素，用无菌研槌研磨，制备成组织悬液。再加组织培养液，使最终为10%组织悬液。以1500r/min离心10min，小心收取上清液低温保存备用。4.3病毒分离4.3.1将上述上清液用维持液作倍比稀释，无菌接种于已长成单层的Vero或RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用 60倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。4.3.2加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层，置于37℃孵育1h。加入维持液置于37℃继续培养，逐日观察细胞病变（CPE），尼帕病毒（NiV)一般在 3d 内出现 CPE。4.3.3无 CPE出现者应盲传两代，即将细胞培养物冻融两次，再接种到单层细胞培养5d～7d。出现CPE者，待70%细胞出现CPE时,收取细胞毒。将感染细胞反复冻融数次，2000r/min离心10min，小心收集上清液，分装后低温保存，待进一步进行病毒鉴定。4.3.4用微量血清中和试验或其他方法对分离的病进行鉴定。4.4结果判定检查各种对照试验，细胞对照正常，无 CPE;阳性对照出现明显的 CPE，说明试验成立。如果试验组出现明显的CPE，表现为细胞圆缩、脱落、裂解，则初步判定为病囊分离阳性；如果分离的细胞培养物能被 NiV