SN_T 3504-2013甲壳类水产品中并殖吸虫囊蚴检疫技术规范.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T壳类水产品中并殖吸虫囊坳检疫技术规范Quarantine protocol for metacercaria of Paragonimus in crustaceans2013-09-16实施2013-03-01发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局（割涂层变真伪 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准甲壳类水产品中并殖吸虫囊蜘检疫技术规范SN/T 3504 --2013*中国标准出版社出版北京市朝阳区和平里西街申2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100015）总编室：（010址中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×1230116印张0.75数188下学2013年9月第一版2013年9月第一次印刷印数1-1600*书号：155066·2-25827 SN/T3504—2013言前本标准按照GB/T1.1--2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、广西大学。本标准主要起草人：李树清、陈韶红、黄维义、张永年、陈志飞、李雯雯、王巧全、张强、王艳、李健、常正山、陈盈。 SN/T3504--2013甲壳类水产品中并殖吸虫囊检疫技术规范1范围本标准规定了并殖吸虫囊坳的形态学鉴定和PCR检测方法。本标准适用于蟹、虾等甲壳类水产品中并殖吸虫囊坳的检疫、流行病学调查和监测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出入境动物检疫采样3概述并殖吸虫俗称肺吸虫，主要寄生于人、犬、猫、鼠等哺乳动物的肺内。人因食入生的、未煮熟的含有并殖吸虫囊坳的蟹类、站和沼虾等水产品而感染。并殖吸虫的分类、分布及生活史参见附录A。4设备和材料4.1仪器和器材4.1.1生物显微镜。4.1.2体视显微镜。4.1.3PCR扩增仪。4.1.4电泳仪。4.1.5凝胶成像系统。4.1.6网筛（10目，40目）4.1.7玻璃珠(425μm~600μm)。4.2试剂和溶液4.2.1 Taq酶(5 U/μL)。4.2.2 2.5 mmol/L dNTP。4.2.325 mmol/L MgCl2。4.2.410×PCR缓冲液（无Mg²+）。4.2.5分子量指示物：100bp~2000bpDNAmarker。4.2.6水（符合GB/T6682中一级水的规定）。4.2.7人工消化液、Tris-乙酸电泳缓冲液（TAE）、琼脂糖凝胶、6×加样缓冲液（配制见附录B)。1 SN/T 3504—20134.3引物扩增并殖吸虫核糖体DNA第二内转录间隔区（ITS2)引物序列为：上游引物3S:5-GGTACCGGTGGATCACTCGGCTCGTG-3*下游引物A28:5-GGGATCCTGGTTAGTTTCTTTTCCTCCGC-35检验步骤5.1样品采集临床上采集的样品为溪蟹、韩和沼虾等思类水汽品深样比均按照GB/T18088执行。5.2样品处理5.2.1捣碎法为保证囊蜘的完整性，推荐使用竹筒和竹棒或淇他类拟替代品）捣碎样品，用生理盐水清洗.用10目网筛过滤，除去粗蟹壳。滤液再用4网筛过滤，滤液置于锥形量简内·加水至量简的最大刻度处，沉淀洗涤至水清，全部沉渣吸人玻璃平通在体视显微镜下，收集囊蜘，用生物显微镜按照5.3进行形态鉴定。5.2.2消化法样品量多时，可使用消化法。将样品用竹简和竹棒捣碎，移入烧杯中，按照样品与人工消化液1：5的比例加人消化液，于37℃消化至无可见的肉组织消化后的慧液用10目网筛过滤，除去粗蟹壳。滤液再用40目网筛过滤，滤液置于锥形量简内，加水至量简的最夫刻度处，沉淀洗涤全水清。全部沉渣吸人玻璃平血，在体视显微镜下，收集坳生物鼎微镜按照进行彤态鉴定。5.2.3囊蜘保存5.鉴定后的部分囊坳保存于7%酒精中或子少量生理盐水中门速冻，另取部分形态一致的蛮勒按5.4.1提取DNA。5.3并殖吸虫囊坳形态鉴定并殖吸虫囊坳一般呈球形或近球胶通常其2层囊壁迎虫种不同.可有3层囊壁或仅1层袭壁。后尾蜘折叠卷曲在囊内，能看见充满黑色颗粒的排泄囊和两侧弯曲的肠管。口吸盘有时可见到.而腹吸盘则常被排泄囊所遮盖，后尾坳与囊壁问可有明显的空隙，也可无空隙。不同种的并殖吸虫囊蜘大小有差异，如卫氏并殖吸虫小囊蝴直径为320um～360um，大囊蝴直径为370μm～400μm。斯氏并殖吸虫囊蜘，直径为400um左右。并殖吸虫囊坳模式图及实物图参见附录C。由于并殖吸虫种类多。囊劾形态相似，仅