SNT 1164.3-2006牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验操作规程.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1164.3—2006牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验操作规程Protocol of ELISA for infectious bovine rhinotracheitis2006-01-26 发布2006-08-16 实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局数码防伪！ 中华人民共和国出人境检验检疫行业标准牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验操作规程SN/T 1164.3-2006中国标准出版社出版北京复兴门外三里河北街16 号邮政编码：100045网址 www. bzcbs. com电话：6852394668517548中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*开本880×12301/16印张0.5字数8千字2006年4月第一版 2006年4月第一次印刷印数 1-2 000本 SN/T 1164.3—2006言前 SN/T1164分为四部分：牛传染性彝气管炎病毒分离操作规程；牛传染性鼻气管炎微量血清中和试验操作规程：牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验操作规程；牛传染性鼻气管炎病毒检测鉴定方法PCR法。本部分为SN/T1164的第3部分。本部分的附录 A为规范性附录。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国云南出人境检验检疫局。本部分主要起草人：肖荣海、周晓黎、徐维加、杨雁雄、应雪松。本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 SN/T 1164.3-2006牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验操作规程1 范围SN/T1164的本部分规定了牛传染性鼻气管炎酶联免疫吸附试验方法。本部分适用于牛传染性鼻气管炎抗体的检测2 规范性引用文件下列文件中的条款通过SN/T1164的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本部分。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3缩语下列缩略语适用于SN/T1164的本部分3. 1IBR牛传染性鼻气管炎infectious bovine rhinotracheitis3. 2ELISA酶联免疫吸附试验izyme-linked immunosorbent assayH**r+44试剂和材料4. 1包被抗原：由指定单位提供4.2血清：标准强阳性、阴性血清，由指定单位提供。被检血清：牛血滑56℃～57℃灭活3Qmin，羊血清58℃～59℃灭活30min。4.34.4酶标记抗抗体：由指定单位提供。4.5溶液：抗原包被缓冲液、封闭液、洗涤液、底物溶液和终止液，见附录A。4.67水：符合GB/T6682分析实验室二级水规格5器械和设备5.1酶标仪。5.2聚苯乙烯微量反应板（96孔酶标板）。5.3单孔道、多孔道可调微量移液器(1 μL、50 μL、100 μL、1000 μL)、微量滴头。5.4 吸管(5 mL、10 mL)。5.5刻度量筒(100 mL、1 000 mL)。5.6 试剂瓶(50 mL、100 mL、500 mL)。5.7 洗涤瓶(500 μL)。 SN/T 1164.3-20065.837℃恒温箱。6 操作步骤6.1包被酶标板：按照提供的包被抗原所附说明书要求，用包被液稀释抗原，包被96孔酶标板，每孔100μL，置4℃冰箱过夜。6.2 洗涤:取出酶标板，甩掉孔内的包被缓冲液，注满洗涤液，1 min～2 min 后再甩干。如此重复五次。洗涤液需在孔内滞留一定时间，以防本试验的非特异性反应，也可用洗板机洗板。6.3封闭：每孔注满封闭液，置 37℃封闭90min，按6.2洗涤1次～2次。置4℃冰箱备用,30d内均可使用。6.4加样：每步加样完毕，均用振荡器充分振荡混匀。6.4.1 标准阴性血清、阳性血清和被检血清均用稀释液作 100 倍稀释。6.4.2每份被检血清加两孔，每孔100μL。6.4.3每板均设标准阴、阳性血清及稀释液对照各两孔，每孔100μL。加样完毕后放37℃温箱作用1 h,按 6.2洗涤。6.5加酶标记抗抗体：每孔加入用稀释液稀释至工作浓度的酶标记抗抗体100 μL，置37℃温度作用1 h,按 6.2洗涤。6.6每孔加底物溶液 100 μL,置室温避光反应约 20 min。6.7终止反应：每孔加终止液50μL。在30min内测定OD值。7 结果判定7.1判定标准：用酶标仪在波长 450 nm下测定OD值，按式(1)计算 S/N值：(1.)S/N =被检血清平均 OD值 / 标准阴性血清平均 OD 值-S/N1.50 判为阴性;-1.50≤S/N≤2.0判为可疑;-S/N2.0判为阳性。7.2凡可疑被检血清均应复检，仍为可疑时