SN_T 2651-2010肉及肉制品中常见致病菌检测方法 基因芯片法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2651—2010肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法Determination of pathogenic bacteria in meat and meat products-Gene chip method2010-11-01 发布2011-05-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局码防饼 SN/T 2651--2010前言本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、博奥生物有限公司暨生物芯片北京国家工程研究中心。本标准主要起草人：肖进文、李应国、刘生峰、王昱、聂福平、谭志、周庆、张亮、臧庆伟。 SN/T 2651--2010肉及肉制品中常见致病菌检测方法基因芯片法1 范围本标准规定了肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌O157:H7的基因芯片检测方法本标准适用于肉及肉制品中沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、空肠弯曲杆菌和大肠杆菌0157:H17的基因芯片检测。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室　生物安全通用要求GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检验SN0170出口食品中沙门氏菌（包括亚利桑那菌)检验方法SN 0172出口食品中金黄色葡萄球菌检验方法SN 0175出口食品中弯曲杆菌检验方法出口食品中单核细胞增生李斯特氏菌检验方法SN/T 0184.1进出口肉、肉制品以及其他食品/中肠出血性大肠杆菌O157:H7检验方法SN/T 09733术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1基因芯片　DNA chip核酸检测探针按照有序的行列格式点制在固相支持物上,通过特定温度下与相应样品进行杂交而用于样品中核酸种类定性分析的一种高通量技术。4 生物安全要求4.1环境要求实验室的安全防护按照GB19489中的有关规定执行。4.2废弃物处理和防止污染措施检测过程中的废弃物需经121℃高压灭菌处理至少30 min后再弃置。检测过程中防止交叉污染的措施按照标准GB/T27403的规定执行。1 SN/T 2651—20105方法概述针对5种目标菌保守基因片段设计引物，提取待检样品增菌液的DNA为模板进行两个独立的多重PCR扩增。扩增产物与固定有 5种目标致病菌特异性探针的基因芯片进行杂交，用芯片扫描仪对杂交芯片进行扫描并判定结果。阳性结果用传统方法确证。6设备和材料6.1高压灭菌锅。6.2恒温培养箱。6.3微需氧培养装置。6.4高速离心机（20000g以上）。6.5 水浴锅(37℃、42℃、70℃)。6.6PCR超净工作台。6.7 PCR 仪。6.8水平式电泳仪。6.9凝胶成像分析系统。6.10水浴摇床6.11基因芯片扫描仪。6.12基因芯片清洗仪(可选）。6.13芯片杂交盒。6.14微量可调移液器和灭菌吸头:2 μL、10 μL、100 μL、200μL、1000 μL。6.15灭菌 PCR反应管。7 培养基和试剂缓冲陈水增菌液(BP)（见附录 A.1）。7.17. 2四硫磺酸盐煌绿增菌液（TTB)（见附录 A.2）。改良缓冲蛋白陈水（MBP)（见附录 A.3）。7.37.4增菌培养液(EB)（见附录 A:4)。7.510%氯化钠胰蛋白陈大豆肉汤（见附录A.5）。7.6弯曲杆菌增菌肉汤（见附录 A.6)。改良 E.C新生霉素增菌肉汤[m(EC)n}(见附录 A.7)。7.77.8电泳级琼脂糖7.9晶芯?食源性致病微生物检测芯片试剂盒17.9. 1 PCR引物序列(参见附录 B)。7.9.2芯片探针序列（参见附录 B)。7.9.3 缓冲液 GA:25 mmol/L EDTA 和 5%SDS,pH8.0。7.9.4缓冲液GB:5mmol/L盐酸胍。1）该试剂盒是博奥生物有限公司提供的产品的商品名，是适合的市售产品的实例，给出这一信息是方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同功效，则可使用这些等效产品。2 SN/T 2651—2010去蛋白液 GD:3 mmol/L盐酸胍。.6漂洗液 PW:2 mmol/L Tris 缓冲液,pH7.5。7.9.7蛋白酶K。吸附柱CB3和收集管。.9Rnase A溶液。7.9.10洗脱缓冲液 TE:10 mmol/L Tris 缓冲液,pH8.0。7.9.11PCR MixI（组成参见附录 C）。7.9.12PCRMixⅡ（组成参见附录C）。7.9. 13Taq 酶(5 U/μL