SN_T 3448-2012桃树黄化植原体检疫鉴定方法.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3448—2012桃树黄化植原体检疫鉴定方法Detection and identification of peach yellows phytoplasma2012~12-12 发布2013-07-01实施中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局 SN/T 3448-2012言前本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。本标准主要起草人：牟海青、陈林、李萍、杨毅、赵文军、朱水芳、王有福。1 SN/T 3448—2012桃树黄化植原体检疫鉴定方法1 范围本标准规定了桃树黄化植原体的检疫和鉴定方法，本标准适用于进出境桃树苗木及接穗中桃树黄化植原体的检疫和鉴定。2 原理2.1 基本信息桃树黄化植原体（peach yellows phytoplasma），软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科(Acholcplasmataceae），植原体候选属（candidatus phytoplas-ma),16 SrI植原体组。2.2方法原理植原体的生物学特性和基因序列等分子生物学信息是该检疫鉴定方法的依据。DAPI作为一种初步筛选植原体的方法；PCR技术灵敏度高、特异性好，RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中,PCR技术与RFLP技术结合作为鉴定桃树黄化植原体的最终方法。3器材和试剂PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。DAPI(4,6-二基-2-苯基吲哚）、PCR缓冲液、MgCl2l、dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物等。4检测鉴定方法4.1 症状观察仔细观察桃树种苗、叶片等，症状描述参见附录A的A.1。4.2DAPI 染色选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4,6-二基-2-苯基吲哚)染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。因植株内植原体分布不均，故每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。4.3电子显微镜观察将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。方法参见附录 B。1 SN/T 3448---20124.4通用引物PCR、电泳检测、产物测序并比对分析发病植物样品总DNA提取方法参见附录C，通用引物PCR凝胶电泳并测序（见附录D）。4.5RFLP图谱检测见附录 E。5结果判定5.1表现症状与A.1描述一致且4.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定可能为桃树黄化植原体，但需通过4.4、4.5方案进一步检测。5.2在4.3检测中，若通过电子显微镜观察，发现桃树韧皮部筛管中含有直径为500μm～1000μm的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体，则可初步判定可能为桃树黄化植原体，但需要4.4、4.5方案的进一步检测。5.3在4.4检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，可初步判定为桃树黄化植原体，经序列测定并比对后，若与D.4中序列同源性大于97.5%，则可用4.5检测方法进一步确认。5.4在4.5检测中，若经通用号物扩增所得序列经17种限制性内切酶酶切后与图E.1一致可判定该样品携带桃树黄化植原体。6样品保存与复核6.1样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出桃树黄化植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理6.2结果记录与资料保存完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。6.3复核由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。 SN/T 3448—2012附录A（资料性附录）植原体生物学特性A.1 症状主要对桃树叶片以及果实进行症状观察。该植原体病害最典型症状为叶片黄化，果实较小、植株长势衰退、提前落叶。A.2 寄主范围桃树是主要的寄主，包括碧桃（Prunuspersica）、毛桃（Amygdaluspersica）等。A.3　传播途径主要由取食植株韧皮部的介体昆虫传播，如叶蝉（Fieberiellaflorii）、蚜虫（Aphidae）等；感病桃树种苗、接穗等调运可以使植原体病原远距离传播。桃