SN_T 3729.6-2013出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法 第6部分：苹果成分检测 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 3729.62013出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法　第6部分：苹果成分检测实时荧光 PCR 法Identification of fruit species in export food and drink-Part 6 : Detection of Malus domestica ingredient--Real-time PCR method2014-06-01实施2013-11-06 发布中华人民共和国发布国家质量监督检验检疫总局符 SN/T 3729.6—2013前創言SN/T3729《出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法》共分为以下10个部分：第1部分：草莓成分检测　PCR法；——第 2部分:杏成分检测实时荧光 PCR法；实时荧光PCR法；—第 3部分:梨成分检测一一第4部分：芒果成分检测　实时荧光PCR法;实时荧光PCR法；一第5部分：木瓜成分检测第6部分：苹果成分检测实时荧光PCR法；一第7部分：葡萄成分检测PCR法;第8部分：山楂成分检测实时荧光PCR法；-第9部分：桃成分检测实时荧光PCR法；-第10部分：香蕉成分检测实时荧光PCR法。本部分为SN/T3729的第6部分。本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本部分主要起草人：陈颖、吴亚君、韩建勋、黄文胜、王斌、邓婷婷、陈双雅、宗卉。1 SN/T 3729.6—2013出口食品及饮料中常见水果品种的鉴定方法第6部分：苹果成分检测实时荧光 PCR法范围1SN/T3729的本部分规定了出口食品和饮料苹果成分的实时荧光PCR检测方法。本部分适用于果汁、果酱及其他以水果为原辅料的食品中苹果成分的定性检测。本部分所规定方法的最低检出限(LOD)为1%（质量份数）2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1苹果Malus domestica蔷薇科苹果亚科苹果属植物，落叶乔木3.2清汁clarified juice经过澄清工艺加工，没有浑浊和沉淀的果汁，3.3浊汁 cloudy juice未经过澄清工艺加工，浑浊但未分层和沉淀的果汁。4缩略语下列缩略语适用于本文件。DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleoside triphosphate)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylammonium bromide)Tris:三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)Taq:水生栖热菌(Thermus aquaticus)1 SN/T 3729.6—2013OD:光度密度(optical density)5　方法提要提取DNA，以DNA为模版，分别采用苹果的特异性检测引物和探针进行实时荧光 PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，进行食品及饮料中苹果成分的检测鉴定，其中以苹果果肉DNA为阳性对照,以非苹果来源的DNA为阴性对照,无菌水作为空白对照。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T 6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针：见表1。表 1引物探针序列引物/探针引物/探针序列（5-→3）扩增片段长度靶基因内参照5端引物CTTGATTTTACCAAAGATGATGA植物核酮糖-1,5-二磷159 bp内参照3端引物TTCTTCGCATGTACCCGCAG酸羟化酶/加氧酶基因苹果5端引物GGAATATGAACGAAAGAGCG苹果核糖体苹果3端引物ATCCGTTGCCGAGAGTCGTT103 bpITS1-5.8S-ITS2 基因苹果探针FAM-TGCGTCGTCGTCTTCGATAA-TAMAR6.2 CTAB 提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/I, Tris-HCl,0.02 mol/L Na2 EDTA.pH CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。6.4三氯甲烷(氯仿）。6.5 异丙醇。6.670%乙醇（体积