硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒.docVIP

硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒 硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒 PAGE/NUMPAGES 硅胶膜型质粒DNA小量提取试剂盒 硅胶膜型?质粒DNA小量提取试剂盒 操作方法 将3~5ml菌液13,000rpm离心30秒采集积淀（菌体）。假如用1.5ml或2ml离心管则需频频离心2~3次。 倒掉上清，将积淀（菌体）完整悬浮于100μl悬浮液（溶液I）中。上清要尽可能去除洁净，可用滤纸吸干。积淀要用混旋器完整悬浮，不然将直接致使下一步的裂解不完全，从而影响质粒DNA的产量和纯度。 加入150μl裂解液（溶液II），柔和地颠倒混匀10次左右，溶液渐渐变得黏稠、清明。 不行用混旋器强烈振荡，不然会使质粒DNA断裂；裂解时间不宜超出5分钟，不然会造成染色体DNA的污染。 加入150μl中和液（溶液III），柔和地颠倒混匀10次左右。 此时可见到白色絮状的染色体DNA及细菌碎片。 5.13,000rpm离心8~10分钟，将上清液当心转移入一个新的1.5ml离心管中， 加入等体积（约  400μl）的联合液，颠倒混匀。 6.将混和液吸入离心纯化柱中，静置起码3分钟，13,000rpm离心30秒，倒掉 采集管中的废液。 此步使处于高盐状态下的质粒DNA与硅胶膜联合后，离心去除杂质。 7.将离心纯化柱从头套入废液采集管中，加入600μl80%异丙醇（或80%乙醇）， 13,000rpm离心1分钟，倒掉采集管中的废液。 假如离心纯化柱底部残留有异丙醇（或乙醇），可用滤纸吸干，不然将影响以 后的酶促反响。此步是清洗质粒DNA中混有的杂质及盐类。 重复第7步一次，尽可能将杂质及残留的乙醇去除。 9.拿出离心纯化柱，将其套入一个洁净的1.5ml离心管，开盖搁置2~3分钟， 使乙醇充分挥发洁净。加入50μlTE缓冲液（若用于测序，则加50μl超纯水） 于硅胶膜上，不可以粘在管壁上。室温下搁置5分钟后，13,000rpm离心1分 钟。 离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没相关系，可开盖离心。TE缓冲液 或无菌超纯水的用量视用户对浓度的要求而定。 将洗脱液从头吸入离心纯化柱中，再洗脱一次。这样能够获取较高产量的质 粒DNA。 11.离心管中采集的液体即是洗脱下来的质粒DNA，取1~2μl电泳（0.8%琼脂糖， 120V，15~20分钟）检测其纯度并目测定量。 若发现有RNA污染，可加入0.5μlRNaseA（10mg/ml），37℃保温30分钟。此 操作不影响后来续实验。 增补说明 ※假如开端菌液体积较大或采集的菌体许多，溶液I、II、III的用量及其余试剂可 相应放大。但操作略有不一样，需要时我们乐于供给帮助。 ※实考证明，少许的RNA污染关于酶切、转变及测序无显然的影响。 常有问题及参照建议 常有问题可能原由参照建议 质粒产量低细胞裂解不充分减少培育物体积。关于高拷贝质粒，培育 物体积不要超出5ml，低拷贝质粒培育物体 积不要超出10ml 按比率增添溶液I与溶液II的体积，使菌体 充分悬浮，而后完整裂解细胞 非转变细胞的大批生长一定在选择条件下扩增质粒DNA 定量不正确经过琼脂糖凝胶电泳进行察看及定量 不适合的保留条件 将质粒DNA溶于无菌超纯水或TE中，于 -20℃保留 菌液培育的时间过长 在新鲜的选择平板上精选一个分开优秀的 单菌落，于37℃振荡培育12~16小时 质粒的拷贝数太低 增添培育物体积，但不要超出10ml 溶液II及联合液有结晶出 将溶液II及联合液置于37℃温浴30min以 现 上，使结晶完整溶解，且在使用前要充分 混匀 洗脱温度过低 加入无菌超纯水或许TE浸透硅胶膜后，于 37~50℃温育2分钟 洗脱液pH7.0 用TE或pH7.0的无菌超纯水洗脱 洗脱液中没 质粒DNA漂出点样孔 增添甘油或蔗糖助沉 有质粒DNA 质粒丢掉 在新鲜的选择平板上精选生长优秀的单克 隆进行细菌培育 对证粒DNA进行从头转变 杂菌污染 在选择平板上精选生长正常的菌落进行摇 菌 电泳时质粒 开环质粒DNA及线状质 加入裂解液后，轻轻混匀，时间不要超出 体现额外条 粒DNA的存在 5min 带 可能存在缺失突变体 有些质粒如cosmids长久保留于E.coli中是 不稳固的，在摇菌时应在选择平板上精选 新鲜的，分开优秀的单克隆 电泳时质粒 存在质粒多聚体 单酶切后，质粒多聚体酶切为线状质粒 体现额外条 DNA,可与染色体DNA的污染相差别 带 存在变性的超螺旋质粒 加入裂解液（溶液II）后，碱裂解时间不要 DNA 超出5分钟 RNA污染 菌体过度，致使RNaseA 减少培育菌液的体积 相对量不足 溶液I搁置时间超出 6个 于100μl溶液I中加入1μlRNase（A10mg/ml） 月 或于洗脱液中加入0.5μlRnaseA，37℃温育 30min以上