《海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的检测 实时荧光RNA恒温扩增法》（报批稿）.pdfVIP

海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的检测 实时荧光RNA恒温扩增法 Detection of Escherichia coli 、Intestinal Enterococci and Vibrio cholera in seawater simultaneous amplification and testing method （报批稿） XX/TXXXXX—XXXX    目 次 前言……………………………………………………………………………………………………………. II 1范围3 2规范性引用文件3 3术语和定义3 4方法原理4 5试剂或材料4 6仪器和设备5 7样品的采集和预处理6 8检测步骤6 9报告结果9 10质量控制10 11废物处理10 附录A（规范性）引物探针序列11 附录B（规范性）检测过程用表13 参考文献14 I II HY/TXXXXX—XXXX 海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的检测 实时荧光RNA恒温扩增法 1 范围 本文件规定了采用实时荧光RNA恒温扩增法检测海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌的方法原理、 试剂和材料、仪器和设备、样品采集和预处理、检测步骤、剩余样品处理、质量控制等内容。 本文件适用于海水中大肠杆菌、肠球菌和霍乱弧菌（O1群和O139群）的活菌检测。淡水、半咸水 及船舶压载水检测可参照使用。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682-2016分析实验室用水规格和试验方法 GB/T12763.6—2007海洋调查规范 第6部分：海洋生物调查 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光RNA恒温扩增simultaneousamplificationandtesting；SAT 核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合，通过对核酸扩增产物的荧光信号进行实时检测，从 而快速准确检测靶标微生物的一种新型核酸检测技术。 3.2 靶标target 用于检测目标微生物的特异性RNA片段序列。 3 HY/TXXXXX—XXXX 3.3 循环阈值cyclethreshold 每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。 3.4 内质控internalcontrol 体外合成的一段RNA片段。 注：其序列与靶标RNA序列不匹配，用于核酸提取和扩增时的质量控制。 4 方法原理 靶标RNA在反转录酶作用下产生互补DNA，RNA聚合酶以互补DNA为模板产生多个RNA拷贝扩增产物， 带有荧光标记的RNA探针和扩增的靶标RNA特异结合产生荧光，由荧光定量PCR仪获得循环阈值（Ct值）， Ct值与初始模板量成反比，根据Ct值判断检测结果。 5 试剂或材料 5.1 实验用水 应符合GB/T6682-2016中一级水的要求。 5.2 样本裂解保存液 50mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）（pH7.0），0.1%（V/V）十二烷基硫酸钠