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microrna基因表达检测技术研究进展 mirna（mirna）是一个非编码和内源性小型钠，约为21.25吨（nt）。经预测, 人类基因组编码了超过1 000种不同的miRNA。近年来国内外研究已经在动植物体内证实了数百种miRNA, 并确定了少数miRNA的功能, 但大部分miRNA的功能尚不清楚。解决这一问题的首要环节是找出各miRNA在组织或细胞中表达的组织和时序特异性。自1993年首次发现miRNA以来, 检测其表达水平的技术方法迅速发展, 虽然传统方法如Northern杂交技术等仍在miRNA表达检测中起着重要作用, 但许多针对miRNA检测的新技术方法不断涌现, 为深入研究miRNA提供了更多的帮助。在此, 作者对传统及最新发展的miRNA表达检测方法作一简要综述, 以期对miRNA研究提供一些思路和启发。 1 mirna的生物合成 1993年, Lee等在对线虫的研究中发现了首个miRNA-lin- 4, 当时有研究指出lin- 4可以抑制lin-14蛋白表达, 但机制不清。直至2000年, 发现第2个miRNA--let-7及其在人类和果蝇中同源体后, 人们逐渐认识到miRNA是一类进化保守, 在生物进化和疾病发展过程中起着调控作用的重要分子, 通过抑制靶基因的表达产生基因沉默效应。越来越多的miRNA得到鉴定, 目前估计人类miRNA总数在800种以上, 是最初预测miRNA种类的3倍以上。 miRNA生物合成是一个复杂的过程, 首先在细胞核内由miRNA基因转录产生pri-miRNA, pri-miRNA经Drosha切割作用释放出长约70 nt的茎环结构—pre-miRNA;pre-miRNA转运至细胞质后经过酶的修饰作用形成成熟的miRNA。miRNA与RNase、解螺旋酶等活性分子构成RNA诱导沉默复合体 (RNA induced silencing complex, RISC) 。RISC通过特异地锚定在靶mRNA上介导目的mRNA的切割或翻译抑制, 从而调控目的基因的表达。 2 mirna检测技术 2.1 mirna在细胞外表达的研究 Northern杂交是检测miRNA表达的一种简便而可靠方法, 不仅用于检测miRNA在组织细胞中的表达水平, 而且结合RNA marker, 可经凝胶电泳检测miRNA的分子大小。 1993年始, Northern杂交应用于miRNA表达谱研究, 也是首个用于半定量检测miRNA的实验技术, 通过将已知浓度梯度的寡核苷酸参照物与待测样品进行平行杂交, 实现对miRNA的半定量检测。而后, Northern杂交成为检测细胞中miRNA表达的常规研究方法之一。Hayashita等用该技术比较正常细胞和肺癌细胞中的表达情况, 发现miR-17-92在肺癌中的表达明显升高。Sempere等用该技术检测了已知的119个miRNA表达谱, 发现一部分在特异组织中表达, 一部分无特异性, 且在不同组织中表达水平各异。 Northern杂交最大的缺点是对样品的需求量较高, 需要微克级样品才能避免假阴性, 有时样品量达到40 μg才会出现明显杂交信号。 2.2 mirna的表达 原位杂交分为细胞和组织内原位杂交, 该技术检测miRNA表达, 可更直观的展示出miRNA的时空表达模式。80年代后期可在福尔马林固定、石蜡包埋的组织中进行原位杂交, 近年来扩展到细胞及亚细胞水平进行miRNA的检测。该技术不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达, 还可在不经分类和分离的情况下, 比较不同细胞系中miRNA的表达水平。Wienholds等首次将LNA探针 (locked nucleic acid-modified probe, LNA) 用于原位杂交技术, 检测了斑马鱼 (Zebrafish) 100余种miRNA的空间表达模式。他们用相同的技术观察了115种在脊椎动物中表达保守的miRNA表达谱, 又用基因芯片技术检测了相同的miRNA在斑马鱼胚胎不同发育阶段的表达谱, 并将二者加以对比。随后Kloosterman等对该技术的重要参数进行优化, 使之逐渐成为分析miRNA表达组织和时序特异性的有力工具。 2.3 mirna在肿瘤临床治疗中的应用 基因芯片技术可以高通量的检测基因表达谱。最初的miRNA基因芯片, 是将反义DNA探针点在尼龙膜上, 然后以5′端放射性标记的miRNA样品杂交, 再经放射自显影获得信号。 至今, 很多研究应用该技术建立了不同物种不同组织中miRNA的表达谱, 亦有研究比较了正常组织和和疾病组织中miRNA表达谱的差异。Liu等用芯片技术检测了miRNA在不同肿瘤细胞中的表达谱, 均经Northern杂交、RT-PCR证实。Calin等用该技术比较了