人工染色体载体课件.pptxVIP

人工染色体载体; 常规载体在工作时都是在不影响质粒或噬菌体复制功能的基础上装载外源DNA片段的，同时保持质粒或噬菌体的基本特性。这样一来，这些载体所装载的容量就受到限制。利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段的载体称为人工染色体载体，其装载外源DNA片段的容量可以与染色体的大小媲美。;一 粘粒载体;（二）粘粒载体的工作原理 粘粒载体的主要工作原理类似l噬菌体载体。在外源片段与载体连接时，粘粒载体相当于l噬菌体载体的左右臂， cos位点通过粘段退火后，再于外源片段相间连接成多联体。当多联体与l噬菌体包装的蛋白质混合时l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割成两个cos位点，并将两个同方cos位点之间的片段包装到l噬菌体颗粒中去。;二 酵母人工染色体载体;（一）YAC载体的复制元件 YAC载体的复制元件是其核心组成成分，骑在酵母中复制的必须元件包括复制起点序列即自主复制序列、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒和两个端粒。这些元件能够满足自主复制、染色体在子代细胞间的分离及保持染色体稳定的需要。;端粒重复序列：是定位于染色体末端的一段序列，用于保护线状DNA不被胞内的核酸酶降解，已形成稳定的结构。 着丝粒：是有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。;（二）YAC载体的工作原理 YAC载体主要是用来构建大片段DNA文库，特别是用来构建高等真核生物的基因组文库，并不用作常规的基因克隆。图示是pYAC4载体的遗传结构图，当用BamH Ⅰ切割成现状后，就形成了一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要順式元件。这些元件在酵母菌中可以驱动染色体的复制和分配，从而决定着个微型染色体可以携带酵母染色体大小的DNA片段。;YAC载体的原理性工作流程：; 对于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，转化到酵母菌后可像染色体一样复制，并随细胞分裂分配到??细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的外源DNA片段的装载导致抑制基因sup4插入失活，从而使重组菌形成红色菌落；而载体自身连接转入到酵母细胞后所形成的菌落为白色。;三 细菌人工染色体载体;（一）BAC载体及其结构组成 BAC载体大小约7.5kb，其本质是一个质粒克隆载体。BAC载体与常见克隆载体的核心区别在于其复制单元的特殊性。 复制单元来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS、启动DNA复制的由ATP驱动的解旋酶（RepE），以及3个确保低拷贝并使质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA、parB、parC）。;（二）BAC载体工作原理 BAC载体的工作原理与常规的质粒克隆载体相似。不同的是，BAC载体装载的是大片段DNA，一般在100～300kb。对如此大的DNA片段一般要通过脉冲场凝胶电泳来分离。另外，由于BAC载体的拷贝数小，制备难度大。为解决这个问题，有的学者将BAC载体作为外源片段克隆到常规高拷贝质粒载体上，从而在大肠杆菌中以多拷贝的形式复制，便于载体的制备，使用时将高拷贝质粒去掉。